菌种的分离与筛选

第一篇：菌种的分离与筛选

一、微生物工业对菌种的要求

(一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。

（二）、微生物工业对菌种的要求是：

（1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力;（2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物;（3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力;（4）能够高效地将原理转化为产品;（5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小;（6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;（7）在发酵过程中产生的泡沫要少;（8）具有抗噬菌体的能力；（9）遗传稳定性，二、工业用微生物菌种的来源及选育

（一）微生物菌种的来源

一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：

（1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；（2）从大自然中采集样品分离；

（3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。

当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。

（二）微生物工业菌种的分离

1、野生菌株的分离、筛选过程（1）新菌种分离与筛选的步骤

菌种分离的流程如下：

标本采集 →标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→ 菌种复筛→性能鉴定→ 菌种保藏

①采样

采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。

采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。②标本预处理 ④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。

⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定，⑥毒性试验：据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。

2、菌种的分离方法

（1）施加选择性压力分离法

主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。（2）随机分离方法

有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。A、抗生素产生菌的分离

抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。Ｂ、抗肿瘤药物产生菌的分离

抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。

B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。

B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。

Ｃ、生长因子产生菌的分离

以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3天后，用紫外线杀司长好的菌落，再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液，培养16小时后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。（3）目的微生物分离 A、根据形态筛选突变株

B、根据平板菌落生化反应筛选变株

透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等。

①透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。

在分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法进行初筛。在选择性培养基中加入碳酸钙，使平板成混状，将样品悬浮液涂抹到平板上进行培养，由于产生菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈，可以轻易地鉴别出来。分离乳酸产生菌时，由于乳酸是一种较强的有机酸，因此，在培养基中加入的碳酸钙不仅有鉴别作用，还有酸中和作用。

②变色圈法：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。如筛选果胶酶产生菌时，用含0.2%果胶为惟一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。在分离谷氨酸产生菌时，可在培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，变色范围在pH6.2～7.6，当pH在6.2以下时为黄色，pH7.6以上为蓝色。若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色，可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌。

③生长圈法：生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌（如E.coliP264）与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。

④抑菌圈法：常用于抗生素产生菌的分离筛选，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。

第二篇：乳酸菌菌种的分离筛选方法解读

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类 氨基酸 维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。

通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。

乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。

乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。

培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。

乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿 酵母膏 油酸 吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法：

利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。

其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。

筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养 48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。2.溴甲酚绿指示剂法：

培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）

筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。

二.菌种的分离筛选 1.培养基：

★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L 预先灭菌碳酸钙5-10g/L PH自然（分离用）

★★1.2牛肉膏 10g/L 蛋白胨 10g/L 酵母膏 10g/L 番茄汁200g/L 葡萄糖 10g/L 吐温0.05% CaCO315-20g/L 溴甲酚绿 0.01% PH6.0-6.5（分离用）★1.3番茄汁碳酸钙培养基： 酵母膏 7.5 g/L 葡萄糖 10 g/L 番茄汁100mL 蛋白胨7.5g/L KH2PO4 2.0 g/L 吐温 0.5 mL PH 6.0-6.5（分离用）1.4葡萄糖 20g/L 酵母膏 10g/L PH 6.0-6.5 1.5蛋白胨 8-10 g/L 酵母膏 3-5g/L 葡萄糖 13-15g/L KH2PO4 1.5-2.0g/L MgSO4 0.3-0.5 g/L MnSO4 0.2-0.25g/L NaAC 3.0-5.0g/L PH 5.5-6.5 1.6蛋白胨 0.8-1.0g/L 糖蜜 3.0-5.0g/L 酵母膏 3-5g/L 玉米浆0.5-1.0g/L KH2PO4 0.1-0.3g/L MgSO4 0.3-0.5g/L NaC13-5g/L 葡萄糖 8-10g/L PH5.5-6.5（发酵或种子培养基）★★1.7 MRS培养基（分离培养计数用）

蛋白胨 10.0g、牛肉膏 10.0g、酵母膏 5.0g、柠檬酸氢二铵 2.0g、葡萄糖 20.0g、吐温 80 1.0mL、乙酸钠 5.0g、磷酸氢二钾 2.0g、硫酸镁 0.58g、硫酸锰 0.25g、琼脂 18.0g、蒸馏水1L, pH 6.5。（分离培养基），当MRS培养基冷却至45～50℃时,加入已灭菌的碳酸钙, 充分混匀,倒平板。1.8 BCP培养基（溴甲酚紫培养基）

乳糖5.0g 蛋白胨 5.0g 酵母膏 3.0g 0.5℅溴甲酚紫10ml 自来水1000ml

pH6.5-7.0（分离用）

1.9 BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒 精溶液0.07ml，0.075Mpa 20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g 溶解后调pH6.5-6.8，0.1 Mpa 20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀，倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。2.分离筛选：

2.1富集培养：取1.0g（1.0ml）于无菌细口瓶中，加入无菌麦芽汁液体培养液于瓶口处，密闭，25-32℃培养48h。若培养基表内出现绢丝波纹物，镜检杆状，革兰氏阳性，初步定为乳酸菌。以同样方法转接2-3次，接种量3-5℅.2.2菌种分离纯化： 溶钙圈法：

富集菌液或样品适当稀释至10-7，混菌法分离，先加入10-12ml MRS培养基 或麦芽汁培养基，凝固后再注入4-5ml水琼脂培养基，制成厌氧环境，30℃或37℃培养2-3天（温度低时间稍长），可出现针头状或圆形稍扁菌落，周围形成透明圈。挑取透明圈大，培养基变黄的菌落，反复划线纯化2-3次，所得单菌落编号，经镜检后，疑似乳酸菌落接种于MRS培养基培养后保存备用。或接入液体培养基中，25-32℃培养24-48h，然后穿刺于MRS培养基或麦芽汁碳酸钙半固体培养基中，25-32℃培养48h保存备用。2.3性能测定： 乳酸菌定性试验：

不同条件下的产酸速率试验：将分离菌种接种于MRS液体培养基中25℃ 37℃温度下培养测不同菌株不同温度的pH。

方法1.吸取发酵液10ml，注入空试管中，加入10℅硫酸1.0ml，在加入2.0 ℅高锰酸钾约1.0ml，此时乳酸转化成乙醛。取滤纸一条，在含氨的硝酸银

溶液中浸湿，横搭在试管口上，将试管徐徐加热至沸腾，使乙醛挥发，若管口滤纸变黑，证明有乳酸生成。

方法2.纸层析法：展开剂为正丁醇：甲醇：水=80：15：5，毛细血管吸取发酵液，多次点样于新华滤纸上，1.5℅标准乳酸为对照，平衡2小时后进行层析，3℅溴甲酚蓝显色计算Rf值。

产酸量测定：5.0ml发酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸馏水10-20ml，酚酞指示剂2滴，用0.1mol/l氢氧化钠滴定至微红色。

醋酸量（g/100mL）= 氢氧化钠摩尔浓度.Vx90.08x10-3 /样品毫升数 x100 同时，进行单因素试验，分别考察醋酸速度，耐高温，耐酒精度，耐低酸度等主要生产性能，选择优势菌株。3.菌株鉴定： 3.1菌落形态：

3.2菌体形态：（革兰氏染色观察）染色镜检：杆状 阳性。3.3乳酸菌运动性检测：半固体穿刺法 3.4生理生化：

3.3.1生化试验：产过氧化氢，产硫化氢，葡萄糖产生，硝酸盐还原，产生吲哚，甲基红，明胶液化，需氧，精氨酸，糖发酵试验。3.3.2生理试验：

乳酸菌产酸能力曲线：将筛选的乳酸菌接种于MRS液体培养基中，25-32℃培养48h，间隔4-6h测定发酵液pH。

食盐对乳酸菌的影响：在MRS液体培养基中，添加0.0℅ 2.0℅ 4.0℅ 6.0℅氯化钠，菌种分别接种于培养基中，32℃培养48h，测定OD值。

溴甲酚绿指示剂法：

原理：溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色，碱性环境呈蓝色，分离培养基配制后PH为6.8，加入溴甲酚绿指示剂呈蓝绿色，产酸后菌落周围变成黄色，较容易鉴别。

培养基：BCG牛乳营养琼脂

初筛：将样品富集液梯度稀释，适温培养，平板上出现扁平的黄色菌落及周围培养基也为黄色初定为乳酸菌。

复筛：将典型菌落转接脱脂乳发酵管，若凝固，无气泡，呈酸性，镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色阳性，连续传代若干次培养，挑选出3-4h能凝固的乳管保存备用。

注：1.乳酸菌筛选常在几种培养基同时进行：

分别在麦芽汁碳酸钙培养基，番茄汁碳酸钙培养基，BCP培养基（溴甲酚紫培养基）同时进行混菌 划线或涂布培养（放厌氧袋），分别25℃ 37℃培养48h。菌落观察：平板表面形成浅色（黄色或白色）小菌落。麦芽汁碳酸钙培养基表面，菌落周围形成透明圈，BCP培养基（溴甲酚紫培养基）周围使紫色的培养基形成黄色包围圈。

触酶反应：厌氧菌一般无触酶（过氧化氢酶），用滴管滴加3.0℅过氧化氢于菌落上，若无气泡产生，证明该菌为触酶阴性。

将各种特征菌落分别接入斜面，培养后保存，进一步生理生化试验，以鉴定分别何种乳酸菌。

2.菌落鉴定：半固体或双平板琼脂利于乳酸菌的生长，菌落出现早。2.1菌落形态观察：乳白色 边缘不整齐，稍呈半球状凸起，实心菌落。

个体形态：半透明 细杆状 链状排列，大量时呈发丝状堆积。初步认为乳杆菌。2.2生化鉴定：在吲哚试验中，加入菌种试管无任何变化，为阴性反应。说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。明胶液化 淀粉水解 氢氧化钾试验均为阴性，说明此菌为乳酸菌。（过氧化氢酶 还原硝酸盐）

糖发酵试验：发酵果糖 半乳糖 葡萄糖 乳糖产酸为阳性反应，其余麦芽糖 蔗糖 棉子糖 鼠李糖产酸为阴性反应。根据手册第九版判断此种乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种。（纤维二糖 甘露醇 山梨醇 七叶苷 水杨苷）2.3乳酸菌生长曲线 pH-t测定结果：

三.几种乳酸菌筛选举例

1.嗜热链球菌：样品来源：市售酸奶 培养基：M17改良培养基，培养温度：42℃，需氧情况：兼性厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离

2.保加利亚乳杆菌：样品来源：市售酸奶，培养基：牛肉浸膏 1.5％，酵母浸膏 0.5％，葡萄糖 3.0％，柠檬酸三铵 0.2％，七水硫酸镁 0.02％，琼脂 1.5％，pH 5.1。培养温度：42℃，需氧情况：兼性厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离法。

3.双歧杆菌：样品来源：婴儿新鲜粪便，培养基：MRS培养基、NPNL培养基、TYP培养基、PTYG培养基，培养温度：37℃，需氧情况：严格厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离法。

读书的好处

1、行万里路，读万卷书。

2、书山有路勤为径，学海无涯苦作舟。

3、读书破万卷，下笔如有神。

4、我所学到的任何有价值的知识都是由自学中得来的。——达尔文

5、少壮不努力，老大徒悲伤。

6、黑发不知勤学早，白首方悔读书迟。——颜真卿

7、宝剑锋从磨砺出，梅花香自苦寒来。

8、读书要三到：心到、眼到、口到

9、玉不琢、不成器，人不学、不知义。

10、一日无书，百事荒废。——陈寿

11、书是人类进步的阶梯。

12、一日不读口生，一日不写手生。

13、我扑在书上，就像饥饿的人扑在面包上。——高尔基

14、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游

15、读一本好书，就如同和一个高尚的人在交谈——歌德

16、读一切好书，就是和许多高尚的人谈话。——笛卡儿

17、学习永远不晚。——高尔基

18、少而好学，如日出之阳；壮而好学，如日中之光；志而好学，如炳烛之光。——刘向

19、学而不思则惘，思而不学则殆。——孔子

20、读书给人以快乐、给人以光彩、给人以才干。——培根

第三篇：菌种筛选方法

菌种筛选方法

在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图5.6.1。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图 5.6.1平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起“形态”大小测定的偏差。

1)纸片培养显色法 将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。

2)变色圈法 将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。3)透明圈法 在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就会形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。

4)生长圈法 利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。

5)抑制圈法 待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。例如：将培养后的单菌落连同周围的小块琼脂用穿孔器取出，以避免其它因素干扰，移入无培养基平皿，继续培养4-5天，使抑制物积累，此时的抑制物难以渗透到其它地方，再将其移入涂布有工具菌的平板，每个琼脂块中心间隔距离为2厘米，培养过夜后，即会出现抑菌圈。抑菌圈的大小反映了琼脂块中积累的抑制物的浓度高低。该法常用于抗生素产生菌的筛选，工具菌常是抗生素敏感菌。由于抗生素分泌处于微生物生长后期，取出琼脂块可以避免各菌落所产生抗生素的相互干扰。典型的例子是春雷霉素生产菌的筛选，见图5.6.2。3 摇瓶培养法 摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分析测定。摇瓶与发酵罐的条件较为接近，所测得的数据就更有实际意义。但是摇瓶培养法需要较多的劳力、设备和时间，所以，摇瓶培养法常用于复筛。但若某些突变性状无法用简便的形态观察或平皿快速检测法等方法检测时，摇瓶培养法也可用于初筛。初筛的摇瓶培养一般是一个菌株只做一次发酵测定，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶，选出3-5个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株。特殊变异菌的筛选方法 上述一般的筛选菌株方法的处理量仍是很大的，为了从存活的每毫升106左右细胞的菌悬液中筛选出几株高产菌株，要进行大量的稀释分离、摇瓶和测定工作。虽然平皿快速检测法作为初筛手段可减少摇瓶和测定的工作量，但稀释分离的工作仍然非常繁重。而且有些高产变异的频率很低，在几百个单细胞中并不一定能筛选到，所以，建立特殊的筛选方法是极其重要的。例如营养缺陷型和抗性突变菌株的筛选有它们的特殊性，营养缺陷型或抗性突变的性状就象一个高效分离的“筛子”，以它为筛选的条件，可以大大加快筛选的进程并有效地防止漏筛。在现代的育种中，常有意以它们作为遗传标记选择亲本或在DNA中设置含这些遗传标记的片段，使菌种筛选工作更具方向性和预见性。本节还将简单介绍其它一些特殊变异株的筛选方法。

4.1 营养缺陷型突变株的筛选 经诱变处理后的菌悬液在筛选前一般应先进行诱变后培养，以促使变异细胞发生分离，防止出现表型延迟现象，筛选出不纯的菌株。营养缺陷型的筛选一般包括浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤。

1)浓缩营养缺陷型菌株 诱变后的细胞群体中大部分存活菌是野生型，而营养缺陷型占的比例相当小，这对分离是很不利的，所以，应该淘汰大量的野生型，以达到浓缩营养缺陷型的目的。常用的浓缩方法有抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。2)进一步检出所需缺陷型 浓缩后的菌液中营养缺陷型的比例较大，但并非全部都是。并且营养缺陷型中也有不同的类型，还需要进一步检出所需要的营养缺陷型。这样就需要采用逐个检出法、夹层培养法和限量补给法等方法进一步检出所需要的营养缺陷型。3)营养缺陷型的鉴定 获得的营养缺陷型菌株还应进一步确认其生长的所需物。菌株较少时，可用生长谱法，若菌株较多时，常采用组合补充培养基法

4.2 抗性突变菌株的筛选 抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有10-6频率的突变体存在，就容易筛选出来。抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段。

1)一次性筛选法 一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。噬菌体抗性菌株常用此方法筛选。将对噬菌体敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量接入含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此时出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌体突变株能在这样的环境中不被裂解而继续生长繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。耐高温菌株在工业发酵中的应用意义在于它可以节约冷却水的用量，尤其是在夏季，并能减少染菌的机会。耐高温菌株所产生酶的热稳定性较高，适用于一些特殊的工艺过程。耐高温菌株也常采用此法筛选。将处理过的菌悬液在一定高温下处理一段时间后再分离。对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的细胞则对高温有较好的耐受性。耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提高醪液酒精浓度。而耐高渗透压的酵母菌株具有积累甘油的性能，可用于甘油发酵。耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得。

2)阶梯性筛选法 药物抗性即抗药性突变株可在培养基中加入一定量的药物或对菌体生长有抑制作用的代谢物结构类似物来一次性筛选，大量细胞中少数抗性菌在这种培养基平板上能长出菌落。但是在相当多的情况下，无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这时，药物抗性突变株的筛选需要应用阶梯性筛选法。因为药物抗性常受多位点基因的控制，所以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物，而对高浓度药物敏感，经“驯化”或诱变处理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培养皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛选到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使暂时耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被遗漏，所以说，阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株的筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以接受的药物浓度情况下

4.3 组成酶变异株的筛选

许多水解酶是诱导酶，只有在含有底物或底物类似物的培养环境中，微生物才会合成这些酶类，所以，诱导酶的生产不仅需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）往往会引起酶合成的减少，诱导物有时又比较昂贵。这些都可能造成这些水解酶工业生产的波动以及生产成本提高。如果控制这些酶合成的调节基因发生了变异，诱导酶就可能转变成组成酶，它的合成与细胞的其它组织蛋白一样，不再需要诱导物的存在。由诱导型的出发菌株诱变筛选出组成型变异株对于水解酶的工业生产具有重要的现实意义。具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法。1)恒化器法 恒化器常被用于微生物的“驯化”。在培养基中添加不能起诱导作用的低浓度底物，接入处理后的菌悬液进行培养，此时出发菌株由于不能被诱导，无法合成有关的诱导酶而不能分解该底物，从而生长速率极慢，而群体中少数组成型变异株则可合成有关的酶，分解利用该底物，生长速率较快。为了提高组成酶变异株的优势，即它在群体中的比例，可以应用恒化器培养技术。随着恒化器培养中不断加入新鲜基质而逐渐增大组成酶变异株的优势，这样就能够比较容易地做进一步的纯化分离。

2)循环培养法 利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。当接种到不含诱导物而含有其它可利用碳源的培养基中时，两种类型菌株同样能较好地生长，但在此环境中组成型突变株已能合成有关的水解酶，而诱导型菌株就不能合成。进而将它们转接入含诱导物的培养基中时，变异株能迅速利用诱导底物进行生长繁殖，而诱导型出发菌株需经历一个诱导合成酶的阶段，两类菌株的生长就不同步了，随着循环交替培养的继续，组成酶变异株所占的比例将逐渐增大。

3)诱导抑制剂法 有些化合物能阻止某些诱导酶的合成，如α-硝基苯基-β-岩藻糖苷对大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的诱导合成有抑制作用，称为诱导抑制剂。当在诱导物和诱导抑制剂同时存在的培养环境中培养待分离菌群时，诱导型菌株不能产生诱导酶，无法正常生长，只有组成型变异株能够利用底物进行生长繁殖。

4.4高分子废弃物分解菌的筛选 随着石油化工和塑料工业的发展，各种高分子包装废弃物日益增多，这些“白色污染”在自然界很难被消化而进入物质循环。设法选育能分解利用这些高分子材料的微生物对于环境保护至关重要。这些高分子材料大多是不溶于水的，直接分离具有分解功能的微生物很困难。为此，有人设计了阶段式筛选法，首先寻找能在与聚乙二醇结构相似的含两个醚键的三甘醇上生长的微生物，接着，诱变筛选能分解聚乙二醇的变异株；或者筛选能以乙二醇、丙二醇为碳源的菌株，继而诱变筛选出能利用聚乙二醇等物质的变异株。这种由简单的聚合物单体入手逐级筛选高分子废弃物分解菌也许是一条有效的筛选思路。

4.5无泡沫菌株及高凝聚性菌株的筛选 有些菌在发酵过程中会产生大量的泡沫，从而造成发酵液满溢，增大了染菌的机会，使发酵体系反应不均匀，也有可能引起某些发酵产物的生物活性丧失，如蛋白酶变性失活。为了避免泡沫的产生，常常需通过牺牲发酵液的装量或加入大量的消泡剂来消除泡沫的不利影响。发酵过程产生泡沫是菌体代谢、培养基和发酵工艺等方面的原因造成的，而菌种是产生泡沫的关键，选育无泡沫或少泡沫菌株可以从根本上解决泡沫问题。有人用气泡上浮法筛选出了无泡沫的酒精酵母。将变异处理后的菌悬液接种入生长培养基中，培养器皿的底部放置无菌压缩空气喷口，培养过程中不断通入无菌空气，形成鼓泡，易产生泡沫的酵母菌会随泡沫而除去，留下的是不易产生泡沫的变异菌株；也有人用苯胺蓝染色法进行筛选，将经过变异处理的菌悬液经培养后涂布在含葡萄糖3%、酵母膏0.5%、苯胺蓝0.005%的平板上培养4天，出发菌株呈浅蓝色，变异菌株因细胞壁成分和结构改变造成与染料结合力改变，少泡沫的变异菌株呈深蓝色。啤酒发酵和单细胞蛋白培养都希望由凝聚性较好的酵母菌株担任发酵菌种，以便于啤酒的澄清和保持良好的风味，以及单细胞蛋白的收集。采用上述的泡沫上浮法也可以除去不易凝聚的细胞，通过改变鼓泡速度的调节，可以获得具不同凝聚性的菌株。

第四篇：酸奶菌种的分离及鉴定

酸奶菌种的分离及鉴定

乳酸菌是指一群通过发酵糖类，产生大量乳酸的细菌总称。乳酸从形态上可分为球菌和杆菌，并且均为革兰氏染色阳性、在缺少氧气的环境中生长良好的兼性厌氧性或厌氧性细菌。目前，对乳酸菌的应用研究，着重于食品（如发酵乳制品、发酵肉制品和泡菜）和医药工业等人类生活密切相关的领域。

目前市售的各种酸奶制品中, 作为发酵剂的乳酸菌, 通常为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌这两株菌。用嗜热链球菌和保加利亚乳酸杆菌混合培养发酵的乳酸饮品能补充人体肠道内的有益菌，维持肠道的微生态平衡，且含有易于吸收的营养素，具有抑制腐败菌、提高消化率、防癌及预防一些传染病等功效，并能为食品提供芳香风味，使食品拥有良好的质地。

保加利亚乳杆菌（L.Bulgarius）:长杆形，直径1-3mm左右,能产生大量的乳酸。酸碱度方面,为耐酸或嗜酸性,因低 pH能防止一些微生物的生长;温度方面,为嗜温至少许嗜热,最适生长温度在37-45℃之间,对低温非常敏感。

嗜热链球菌（S.thermophilus）：卵圆形，直径0.7－0.9微米，呈对或链状排列，无运动性。为健康人肠道正常菌群，可在人体肠道中生长、繁殖。可直接补充人体正常生理细菌，调整肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌。

本研究对市售主要品牌酸奶中（河南花花乳业生产的酸奶）乳酸菌进行了分离鉴定，并进一步探讨制备酸奶条件（温度、时间等），以达到最佳的天然酸奶质量效果。

一、实验内容

（1）乳酸菌的分离纯化

1．无菌操作倒平板、十倍稀释、划线分离，恒温培养

2．菌落观察与镜检 3．筛选生产用菌株（2）优化酸奶制作条件

1．制备发酵液

2．不同条件下，接种发酵菌剂并发酵生产 3．观察发酵情况

4．品尝发酵产品，进行质量评价 5．记录结果

二、实验器材

1）菌种：新鲜乳酸饮料（标记只含有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）

2）试剂：脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙；

0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯)、20gCaCO3固体、酵母膏20g、琼脂30g

香柏油、脱脂奶粉100g、蔗糖10g；

3）仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超净工作台、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、牛角匙、电炉、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、棉塞、吸管、线绳、标签、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯、酒精灯、石棉网、接种针（环）、擦镜纸

四、实验方法

4.1乳酸菌的分离纯化 4.1.1分离

(1)配制BCG牛乳培养基，分装三角瓶，包扎，灭菌备用。

BCG牛乳培养基配制

A溶液：脱脂乳粉100g,水500ml，加入1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液1ml，80℃灭菌20min。（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）

B溶液：酵母膏10g，水500ml，琼脂20g，PH6.8，121℃湿热灭菌20min。以灭菌操作趁热将A溶液和B溶液混合均匀后倒平板。（2）样品的处理

按照无菌操作要求，从市售新鲜酸乳中吸取10ml检样，放入装有90ml无菌水的三角瓶内，振摇混匀。（3）分离方法 ①倒培养基

在无菌室，先用紫外线照射半小时把表面菌灭了，在通风10min后，每培养皿倾注约15ml左右已溶化的BCG牛乳培养基，立即放在桌上摇匀，冷却凝固后即成平板。②十倍稀释法

将检样充分摇匀后，用十倍稀释法稀释成10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-5各种稀释度的样品液。目的是为了确定哪个稀释度最适宜。一般在培养基上长处50-300个菌落的稀释度为最佳。③分离

在BCG牛乳培养基琼脂平板上划线分离，每稀释度做两个平皿。置40℃培养箱中培养48h。如出现圆形稍扁平的黄色菌落及周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。4.1.2鉴别

（1）配制脱脂乳试管培养基，分装试管，包扎，灭菌备用。脱脂乳试管培养基成分：20g脱脂奶粉，285ml灭菌水。配制好的脱脂乳培养基分装到15支试管中。

（2）选取经初步鉴定的乳酸菌典型菌落，用接种环挑取转至脱脂乳试管中，40℃培养箱中培养8～24h。若牛乳出现凝固，无汽泡，呈酸性，涂片镜检细胞为杆状或链球状（两种形状的菌种分别选入），革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代4～6次，最终选择出在3～6h能凝固的牛乳管，作菌种待用 4.2优化酸奶制作条件（1）乳酸菌培养基的制作

将脱脂乳和水以1:7（W/V）的比例，同时加入6%的蔗糖，充分混合，于80～85℃灭菌10～15min，冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。即脱脂乳14.3g，无菌水100ml，蔗糖6g。（2）接种

将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种等量混合菌液作为发酵菌剂，均以2～5%的接种量分别接入培养基质中即为饮料发酵液。接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的发酵液重复分装12瓶，将瓶盖拧紧密封。（3）发酵

将接种后的酸乳瓶置30℃，36℃和42℃培养箱中培养2或4h时。培养时注意观察，出现凝乳后停止培养。然后转入4～5℃冰箱中冷藏24h以上。经此后熟阶段，达到酸度适中（pH4～4.5）,凝块均匀致密,无乳清晰出,无汽泡,获得较好口感和特有风味。（4）发酵产物鉴定——纸层析法 将分离的纯菌种接种到乳酸菌葡萄糖发酵培养基上，40℃培养48h。取产酸不产气的液体试管中发酵液做纸层析。展开剂：水30mL、苯甲醇150mL、正丁醇150mL、甲酸3.3mL。显色剂 ： 将1.6%的溴酚蓝酒精溶液用0.1 mol／L的 NaOH调pH到6.7。显色后，分别测定发酵液与2%标准乳酸的Rf值，确定发酵产物中是否有乳酸

五、预期结果

1．分离鉴定获得嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌

2．获得酸奶制作的最佳条件

六、实验进度

第五篇：淀粉降解菌的分离与筛选实验与总结

第一章

绪

论

1.1 简介

1.1.1 淀粉

淀粉是葡萄糖的高聚体，通式是(C6H10O5)n，水解到二糖阶段为麦芽糖，化学式是(C12H22O11），完全水解后得到葡萄糖，化学式是(C6H12O6)。淀粉有直链淀粉和支链淀粉两类。淀粉是植物体中贮存的养分，贮存在种子和块茎中，各类植物中的淀粉含量都较高。

淀粉可分为直链淀粉（糖淀粉）和支链淀粉（胶淀粉）。前者为无分支的螺旋结构； 后者以24~30个葡萄糖残基以α-1,4-糖苷键首尾相连而成，在支链处为α-1,6-糖苷键。直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色。这并非是淀粉与碘发生了化学反应(reaction)，而是产生相互作用(interaction)，而是淀粉螺旋中央空穴恰能容下碘分子，通过范德华力，两者形成一种蓝黑色错合物。实验证明，单独的碘分子不能使淀粉变蓝，实际上使淀粉变蓝的是碘分子离子。

本实验的检测方式则利用了直链淀粉遇碘呈蓝色的特点。1.1.2 淀粉废水的产生

淀粉是一种重要的化工原料，广泛应用于食品、化工、纺织、造 纸、医药等行业。而在淀粉生产中会排放大量废水属高浓度有机废水，其 COD 浓度几千甚至上万，BOD 浓度也有几千，SS量也较高。如将废水直接排放，不仅是水资源的巨大浪费，而且将造成严重的环境污染。因此，国内外学者都在力求研究出一种快速、高效、低能耗的淀粉废水处理工艺。1.1.3 淀粉废水的处理方式

对于淀粉废水的治理，由于其污染物浓度高，危害大的特点，所以普通的化学治理方法难以达到很好的治理效果。目前对于淀粉废水的处理研究广泛采用生物治理方式，其技术方案大致包括厌氧生物处理法和好氧生物处理法。

1.2 国内外的研究进展

续前面所提到的厌氧生物处理法和好氧生物处理法，下面笔者将简单介绍两种方式的应用特点。(1)厌氧生物法

厌氧法处理淀粉废水，其最终产物是以甲烷为主的可燃气体，可作为能源回收利用；剩余污泥量少且易于脱水浓缩，可作为肥料使用；处理工艺运转费用低。在当前能源日益紧张的形势下，该方法作为一种低能耗，可回收资源的处理工艺日益受到世界各国的重视。近年来，厌氧发酵法处理淀粉废水主要有升流式厌氧污泥床(UASB)、厌氧流化床(AFB)、厌氧接触法(ACP)、两相厌氧消化法(TPAD)和厌氧滤池(AF)等。(2)好氧生物法

同厌氧生物法相比，好氧生物处理法具有处理能力强、出水水质好、占地少的优点，因此被当前各国广泛应用。近几十年来，国内外对好氧生物处理法的净化机理和曝气原理进行了大量的实验研究，使好氧生物处理法在设计和运行方面有了很大的改进和革新，特别是在 处理高浓度有机废水方面，取得了一定的成果。但与厌氧法相比，好氧生物法在处理淀粉加工废水方面有许多不足之处，例 如需要充氧、动力消耗大、无能量回收、微生物所需营养多和污泥量大等适合处理低浓度的有机废水。而淀粉废水的 COD 一般较大，所以在淀粉废水的处理中单独应用的较少，主要是活性污泥法、接触氧化法、生物氧化塘法和 SBR 法。在淀粉加工废水的处理中，好氧生物处理一般用作后续处理。

1.3 实验目的与意义

1.3.1 实验目的

(1).掌握微生物分离和筛选的基本方法及技术(2).巩固微生物实验操作的能力 1.3.2 实验意义

淀粉废水中的污染物浓度高，危害大，普通的化学治理方法又难以达到很好的治理效果，如果任其肆意泛滥，势必影响到生态环境和人民的身体健康，长远来看这更会影响到我国人口、经济、社会、资源、环境等各方面的可持续发展。由此，淀粉废水问题俨然成为了一个大问题，如此对其治理也更加是任重而道远。目前对于淀粉废水的处理研究广泛采用生物治理方式，但多种方案都有一定的欠缺之处，一直没有一个完善合理的办法来解决淀粉废水的问题。所以我们有必要去深入学习并领悟对其处理的方案及过程。

微生物方法对环境污染的治理有着十分重要的作用及非常可观的前景，所以对于每一个环境工程专业的同学接触同微生物分离与筛选有关的实验都是有重要价值，无论是对于理论的理解，对专业的认识，还是对实践的把握都是有着深刻意义的。

第2章

实验的材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验仪器

500ml烧杯*1，500ml锥形瓶*1，250ml锥形瓶*1，培养皿*10，试管*5，1ml移液管*1，10ml移液管*1，酒精灯*1，加热套*1，棉塞，棉绳，报纸若干。2.1.2实验药品

活性污泥，(NH4)2SO4 5g，KH2PO4 5g，淀粉5g，蛋白胨1.5g，牛肉膏3g，琼脂8g，蒸馏水400ml，（盐酸，氢氧化钠适量）

2.2 实验方法

2.2.1 实验原理

淀粉酶能使淀粉分解成葡萄糖，而淀粉与碘液发生反应形成蓝色化合物，葡萄糖不与碘液发生反应形成蓝色化合物。能分泌淀粉酶的菌落能在周围形成淀粉圈，从而通过碘液即可筛选出淀粉酶产生菌。

在活性污泥中的微生物通过初筛、复筛等过程可以达到分离的目的。初筛是对所得的纯种进行检测。由于淀粉酶是胞外酶，在分离培养基中加适量可溶淀粉通过平板透明圈法来检测淀粉酶产生菌。筛选透明圈比值大的菌株接种到培养基中进行培养。

2.2.2 实验步骤

1.固体淀粉培养基（周二）

固体培养基（NH4）2SO4

5g，KH2PO

45g，淀粉5g，蛋白胨1.5g，牛肉膏3g，琼脂8g，蒸馏水400ml，pH 7.0—7.5放于烧杯在加热套上加热，待瓶中颗粒完全融化后停止加热并倒入锥形瓶（500ml）然后用棉塞塞住瓶口，再用棉绳系好。试管、培养皿、移液管、锥形瓶一同高压蒸汽灭菌。2.培养（周三）

取5支试管（无菌），用移液管（无菌）吸取1mL活性污泥放入装有9.0mL无菌水的试管中吹吸数次混匀后即为10-1，再用无菌移液管吸取10-1的菌悬液1mL放入装有9.0mL无菌水的试管中吹吸数次混匀即为l0-2稀释液，照此方法分别制成l0-3～l0-5的稀释液。将10-1～10-5稀释液1mL涂布于平板培养基表面。用对应的移液管按浓度顺序依低到高分别往培养皿中各加1ml菌液，并标注对应的标签为10-1～10-5，在无菌条件下往各个培养皿中加入加热后适当温度的培养液，置于37℃的恒温培养箱中培养24h（可适当延长）。3.初筛（周四）

制作两个平板，在长出的菌落中，找出独立菌株并滴加碘液，挑取有淀粉水解圈的单菌落，在两个平板进行划线并培养24h（37℃）（时间可调整）。4.复筛（周五）

两个平板初筛菌株在同一块平板上分别划线培养，培养72h（37℃）（时间可调整）。5.精筛（周一）

用滴加碘液的方式挑选出最佳菌株 6.菌种鉴定（周二）

最后通过观察筛选到的菌株的菌落大小、形态，颜色及革兰氏染色等情况对筛选到的菌株进行初步鉴定。

（以上内容为原定步骤，在实际操作中由于条件变化情况，个别细节会有所改动，下文将说明）

第3章

实验过程与结果

3.1 实验过程

按照试验设计步骤的大方向进行试验，个别细节有所改变，具体过程及试验时间如下：

(1)配置固体淀粉培养基（周二）

固体培养基（NH4）2SO4 5g，KH2PO

45g，淀粉5g，蛋白胨1.5g，牛肉膏3g，琼脂8g，蒸馏水400ml，pH 7.0—7.5放于烧杯在加热套上加热，待瓶中颗粒完全融化后停止加热并倒入锥形瓶（500ml）然后用棉塞塞住瓶口，再用棉绳系好。试管、培养皿、移液管、锥形瓶一同高压蒸汽灭菌。(2)培养（周三）

取5支试管（无菌），用移液管（无菌）吸取1mL活性污泥放入装有9.0mL无菌水的试管中吹吸数次混匀后即为10-1，再用无菌移液管吸取10-1的菌悬液1mL放入装有9.0mL无菌水的试管中吹吸数次混匀即为l0-2稀释液，照此方法分别制成l0-3～l0-5的稀释液。将10-1～10-5稀释液1mL涂布于平板培养基表面。用对应的移液管按浓度顺序依低到高分别往培养皿中各加1ml菌液，并标注对应的-1-5标签为10～10，在无菌条件下往各个培养皿中加入加热后适当温度的培养液，置于37℃的恒温培养箱中培养48h。培养24h后取培养基进行观察，并无明显菌落生成。

(3)初筛（周五）

经48h培养后已经有较多菌株生成，通过滴加碘液选取几株长势较好，水解圈较大的菌株（图一）

制作两个平板，在长出的菌落中，滴加碘液选取的菌株挑取出来，在两个平板进行划线并在37℃的恒温箱中培养72h。

(5)复筛（周一）

选取两个平板中经初筛后长势较好的菌株（图二）在同一块平板上分别划线，在37℃的恒温箱中培养24h。

3.2 实验结果

菌种鉴定（周二）

最后通过革兰氏染色对筛选到的菌株进行鉴定。染色后的显微观察图（图三）

最终观察发现该菌落为白色湿润，易挑取。革兰氏染色后的显微观察为红色杆状菌体。

6

结

论

经过此次实验，本组同学成功地筛选和分离出了一株淀粉降解菌，即在淀粉培养基内的该菌株附近有明显的水解圈，且经碘液检测水解圈内的淀粉已经水解。同时本组采用的方法有简便、易行、快速的优点。

通过对整个环境处理方式的观察，废水处理工艺技术越来越向着多种技术组合为一体的新技术、新工艺发展，将其他物理、化学法同生物法相结合的综合手段往往具有效率高，运行好等诸多优点。可以看出，环境废水处理正朝着综合、系统、高科技的方向发展，不仅对于淀粉废水，甚至对于整个工业的发展都是是必不可少的配套技术，其意义十分深远。

但是，对废水的治理毕竟还只是一种被动的环境保护手段，不能从根本上解决环境和生产之间的矛盾，所以在淀粉产品开发及生产过程中，应尽量优化原料的使用和加工的手段，从污染源头削减产污量，使废消除在生产过程中，最终实现环境、经济、效益的统一。

个人体会与建议

以下是本人对实验操作过程中出现问题的思考总结：

1.固体培养基配方中琼脂的成分偏低，造成培养基凝固性差，给划线培养增加了较大的难度。

2.没有设置关于降解菌对淀粉降解能力测定的实验环节，未能取得有说服力的实验数据。

3.实验操作水平不高，影响实验效率。

4.理论知识及实验经验缺乏，不能准确预计菌落生长所需的时间。

个人体会

本次实验我们以小组的形式进行了从活性污泥中分离和筛选出具有特定功能的环境微生物，对其功能进行了初步的鉴定，及观察菌落形态、染色并镜检对其进行菌种鉴定的过程。

这是一个综合的技术训练，通过这次训练，让我对环境微生物的作用的理解更为加深了，而且更加深刻的明白了实践与理论相结合的重要性。

建议

如果条件允许希望可以优化实验设施，改善实验条件