第一篇：第6章 基因组DNA的提取
第六章 基因组DNA的提取
第一节 概 述
基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同； 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。
本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料，学习基因组DNA提取的一般方法。
第二节 从植物组织提取基因组DNA
一、材料
水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。
二、设备
移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。
三、试剂
1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl，pH8.0，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5% SDS。
2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。3、80：4：16/氯仿：戊醇：乙醇
4、RnaseA母液：配方见第一章。
5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。
四、操作步骤：
（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取
1.在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ，60℃水浴预热。
2.水稻幼苗或叶子5-10g，剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，60℃水浴保温30-60分钟(时间长，DNA产量高)，不时摇动。
3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀(需带手套，防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟，使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
4.室温下5000rpm离心5分钟。
5.仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入1倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
6.在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。
7.如DNA不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心5分钟，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。
8.将DNA溶液3000rpm离心5分钟，上清液倒入干净的5ml离心管。
9.加入5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃ 10分钟，除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。
10.加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀。
11.用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。
12.将DNA重溶解于1ml TE，-20贮存。
13.取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍，测定OD260/OD280，检测DNA含量及质量。
[注意] 5g样品可保证获得500μg DNA，足供RFLP、PCR等分析之用。
（二）.从李(苹果)叶子提取基因组DNA
1.取3-5克嫩叶，液氮磨成粉状。
2.加入提取缓冲液Ⅱ10ml，再研磨至溶浆状。10000rpm，10min。
3.去上清液，沉淀加提取液Ⅰ20ml，混匀。65℃，30-60min，常摇动。
4.同本节
（一）中步骤3-13操作。
第三节 从动物组织提取基因组DNA
一、材料
哺乳动物新鲜组织。
二、设备
移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。
三、试剂
1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4，10mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA。
2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K(20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。
四、操作步骤：
1.切取组织5g左右，剔除结缔组织，吸水纸吸干血液，剪碎放入研钵(越细越好)。
2.倒入液氮，磨成粉末，加10ml分离缓冲液。
3.加1ml 10% SDS，混匀，此时样品变得很粘稠。
4.加50ul或1mg 蛋白酶 K，37℃保温1-2小时，直到组织完全解体。
5.加1ml 5mol/L NaCl，混匀，5000rpm离心数秒钟。
6.取上清液于新离心管，用等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提。待分层后，3000rpm离心 5分钟。
7.取上层水相至干净离心管，加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。
8.移去上层乙醚，保留下层水相。
9.加1/10 体积3mol/L NaAc，及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。
10.用玻棒钩出DNA沉淀，70%乙醇中漂洗后，在吸水纸上吸干，溶解于1ml TE中，-20℃保存。
11.如果DNA溶液中有不溶解颗粒，可在5000rpm短暂离心，取上清； 如要除去其中的RNA，可加5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃保温30分钟，用酚抽提后，按步骤9-10重沉淀DNA。
第四节 细菌基因组DNA的制备
一、材料
细菌培养物。
二、设备
移液管，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。
三、试剂
1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O，缓慢加入10g CTAB，加水至100ml。
2、其它试剂：氯仿：异戊醇(24：1)，酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K(20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。
四、操作步骤：
1.100ml 细菌过夜培养液，5000rpm离心10分钟，去上清液。
2.加9.5ml TE悬浮沉淀，并加0.5ml 10% SDS，50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K，混匀，37℃保温1小时。
3.加1.5ml 5mol/L NaCl，混匀。
4.加1.5ml CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20分钟。
5.用等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提，5000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管。
6.用等体积氯仿：异戊醇(24：1)抽提，取上清液移至干净管中。
7.加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10分钟，沉淀DNA。
8.用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于1ml TE，-20℃保存。如DNA沉淀无法捞出，可5000rpm离心，使DNA沉淀。
9.如要除去其中的RNA，可以按本章第三节中操作步骤处理。
第五节 基因组DNA的检测
上述方法得到的DNA一般可以用作Southern，RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同，得到的DNA产量及质量均不同，有时DNA中含有酚类和多糖类物质，会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后，均需检测DNA的产量和质量。
1.DNA溶液稀释20-30倍后，测定OD260 /OD280 比值，明确DNA的含量和质量。
2.取2-5μl 在0.7% agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。
3.取2μg DNA，用10单位(U)HindⅢ酶切过夜，0.7% agarose胶上电泳，检测能否完全酶解(做RFLP，DNA必须完全酶解)。
如果DNA中所含杂质多，不能完全酶切，或小分子DNA多，影响接续的分析和操作，可以用下列方法处理：
（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。
（2）酚：氯仿抽提，去除蛋白质和多糖。
（3）Sepharose柱过滤，去除酚类、多糖和小分子DNA。
（4）CsCl梯度离心，去除杂质，分离大片段DNA(可用作文库构建)。
思考题：
1.为什么构建DNA文库时，一定要用大分子DNA？
2.如何检测和保证DNA的质量？
第二篇：植物基因组DNA提取
植物基因组DNA提取
一、实验目的
1、掌握植物基因组总DNA的抽提方法和基本原理。
2、学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。
二、实验原理
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
三、实验仪器及试剂
实验仪器：高速离心机；烘箱；冰箱；水浴锅；高压灭菌锅；Nanodrop。
实验试剂：玻璃珠，十二烷基磺酸钠(SDS)；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸（EDTA）；氯化钠；苯酚；氯仿；无水乙醇等。
四、实验步骤
1.SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。
2.将叶片置于1.5ml离心管中，液氮速冻，组织研磨器打样。3.加入700 l的SDS提取缓冲液，涡旋摇匀。
4.置于65℃的水浴中，每隔10 min轻轻摇动，30 min后取出。5.加入200 l KAc溶液，摇匀，放入-20℃冰箱30 min。
6.10000 rpm离心5 min，上清移至新离心管中，12000 rpm离心5 min。7.上清移至新离心管中，加入700 l异丙醇，-20℃冰箱30 min。8.10000 rpm离心5 min，弃上清，加入500 l 70%乙醇漂洗。9.弃液体，晾干。
10.DNA纯度与浓度测定（使用nanodrop）。
（1）DNA纯度：DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。
OD260/OD280 1.8：说明较纯；
OD260/OD280 1.8：说明可能有RNA污染；
OD260/OD280 1.8：说明可能有蛋白质污染。
五、注意事项
1.叶片磨得越细越好。2.注意移液器的正确使用。
3.由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。
六、结果与分析
1.植物DNA提取所用试剂的作用？ 2.植物DNA提取的关键步骤有哪些？ 3.植物DNA提取后的用途有哪些？
4.从化学结构、化学性质、存在场所以及功能等方面比较DNA和RNA的异同。
第三篇：木本植物基因组DNA提取方法的对比研究开题报告
1.选题依据
1.1 论文题目及研究领域
1.1.1 论文题目: 木本植物基因组ＤＮＡ提取方法的对比研究 1.1.2 研究领域: 木本植物DNA的提取研究 1.2 论文研究的理论意义和应用价值
DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。植物DNA的提取和纯化是植物基因工程研究的基础操作，实施分子标记，基因文库的构建，基因分离及遗传转化和鉴定等都是以提取DNA为前提。如何简捷高效地提取到纯净、合格的DNA分子，一直是植物生物学者关注的问题。
随着DNA分子标记技术和重组DNA技术的发展，制备完整、纯度较高的基因组DNA日益显得重要。我们在进行木本植物DNA水平遗传多样性研究时，首先遇到的问题是如何快速获得较完整、纯度较高的基因组DNA。由于植物细胞与动物细胞不同，具有一层坚硬的细胞壁，且含有较多的多糖、色素、脂质和多酚等物质，给植物DNA提取带来很多困难，特别是多糖和多酚类物质不易与DNA分开。相对于草本植物，多年生木本植物的次生代谢类物质含量更高，高质量的DNA提取难度更大[1]。
大多数植物DNA提取方法所提取得到的DNA粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖、单宁和色素等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去，大多数蛋白质可通过酚-氯仿-异戊醇处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA可通过经RNase 处理后除去。但大多数木本植物富含多糖、多酚类物质，DNA常受到严重的多酚污染，造成DNA沉淀物难以溶解或溶液色深；多糖污染直接影响基因组DNA的限制性核酸内切酶的酶切效果。多酚类、多糖物质的污染会造成AFLP酶切连接等后续实验效果差，甚至后续PCR没有扩增产物[2]。在大多数木本植物基因组DNA的提取方法中，SDS法和CTAB法是目前最为常用的两种方法。
本试验以细胞生物学研究为基础，以如何获取高质量、高纯度DNA为目的，比较CTAB法和SDS法红豆杉和银杏基因组DNA的提取效果，对两种方法提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析和紫外吸收分析，分别对两种方法所提取的红豆杉和银杏基因组DNA的效率和质量进行分析，从中选出一种更适合木本植物基因组DNA的提取方法。
1.3 DNA提取研究概况和发展趋势
Avery在1944年的研究报告中写道：“当溶液中酒精的体积达到9/10时，有纤维状物质析出。如稍加搅拌，它就会象棉线在线轴上一样绕在硬棒上，溶液中的其它成份则呈颗粒状沉淀。溶解纤维状物质并重复数次，可提高其纯度。这一物质具有很强的生物学活性，初步实验证实，它很可能就是DNA（谁能想到！）”。对DNA分子的物理化学研究导致了现代生物学翻天覆地的革命，这更是Avery所没有想到。Fricdrich Miescher ,瑞士生物学家，有机化学家。1868年医学毕业以后，在著名的有机化学家Hoppe-Seyle的实验室以脓细胞为材料，研究淋巴细胞的组成。1869年他从脓细胞的细胞核中分离出含有大量磷的“核素”即是DNA,是人类第一次真正提取的的DNA。
年代初,DNA被证明是所有生物最主要的遗传物质。随着生物化学、分子生物学、遗传学的发展,基因工程和生物技术的创立,DNA的有关技术也得到了飞速发展。DNA提取方法成了这些研究和应用中最重要的技术之一。目前已经建立了用于各种不同目的的DNA提取方法,这些方法也被用于生物学,尤其是生物工程的各个方面。但是,对于不同的植物样品,由于其组织成分的差异,采取的DNA 提取方法不完全一致。.文献综述
2.1 南方红豆杉概况
红豆杉属(Taxus L．)植物属红豆杉科，为常绿乔木或灌木。红豆杉(Taxus mairei)又名紫杉、赤柏松，是第三世纪孑遗植物，被称为植物王国里的“活化石”，因其资源稀少，被列为世界珍稀树种加以保护，在我国为珍稀濒危物种。在几千万年的历史长河中，红豆杉是历经强度阳光、低薄空气、高温干旱、严寒冰川等地球气候巨变的考验，演化遗留下来的物种。其树体极大的适应存活能力所具有的各种生物石碱、化合物，既是本身生存的需要，也是现在被人类认识和开发的珍稀贵重药物。南方红豆杉广泛分布福建、浙江、安徽、江西、湖南、湖北、四川等省，生于海拔1300米以下，喜湿润的微酸性粘质土壤，多生长在山的中下部及沟谷旁，常与刺栲、丝栗栲、甜槠、木荷、杜英、枫香、杉木等混生。2.2 南方红豆杉的化学组分
根据国家标准共测定我国南方红豆杉的平均化学指标分别为(10项): 原料含水率7.94﹪、冷水抽提物0.385﹪、热水抽提物0.765 ﹪、乙醚抽出物2.855﹪、NAOH抽出物12.17 ﹪、苯醇抽出物1.391 ﹪、木素含量27.01 ﹪、半纤维素含量11.78 ﹪、综纤维素含量65.5 ﹪、PH值5.33[3]。2.3 红豆杉主要价值
红豆杉因其次生代谢物质紫杉醇良好的抗癌效果而受到人类的关注，从红豆杉树皮和嫩叶中提取的紫杉醇，是继阿霉素和顺铂之后被公认最好的广普、强活性天然抗癌药。红豆杉除了重要的药用价值以外，其独特的外观造型、四季常青的鲜艳绿色，又是不可多得的绿化树种，具有很高的观赏价值。其次红豆杉属植物木材由于其优良品质还是不可多得的木材树种。2.4 银杏概况
银杏（Ginkgo Liloba L.）俗称白果，公孙树。最早出现于3.45亿年前的石炭纪，曾广泛分布于北半球的欧、亚、美洲，与动物界的恐龙一样称王称霸于世，至50万年前，发生了第四纪冰川运动，地球突然变冷，绝大多数银杏类植物濒于绝种，唯有我国自然条件优越，才奇迹般的保存下来。所以，科学家称它为“活化石”，“植物界的熊猫”。2.5 银杏主要价值
银杏叶也具有重要的药用价值。到目前为止已知其化学成分的银杏叶提取物多达160余种。主要有黄酮类、萜类、酚类、生物碱、聚异戊烯、奎宁酸、亚油酸、蟒草酸、抗坏血酸、a-已烯醛、白果醇、白果酮等。中国科学院植物所等单位于60年代用银杏叶研制出舒血宁针剂，经试验对冠心病、心绞痛、脑血管疾病有一定的疗效。同时，银杏叶也可以作为农药使用[4]。
3.实验原理
2.1 CTAB法提取原理
CTAB(cetyltriethyammoniumb romide,十六烷基三甲基溴化铵)法是一种快速简便提取植物基因组DNA的方法：先将新鲜的叶片放在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加入CTAB分离缓冲液。再经氯仿-异戊醇抽体除去蛋白质，最后得到DNA。
2.2 SDS法提取原理
SDS法(Sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸钠)先将新鲜的叶片在液氮中研磨破碎其细胞壁，然后加入SDS使其细胞膜破裂。并同时将蛋白质、多糖等杂质同核酸分开。加入KAc可使SDS—蛋白质复合物转变为更小的钾盐形式，使沉淀更加完全[5]。
2.3 紫外吸收法分析原理
组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长为25038 ［3］丁晓东，吕柳新.从顽拗植物荔枝中提取基因组DNA技术的研究［J］.应用与环境生物学报.2000，6(2)：142370.［5］王景雪, 孙毅, 高武军.-种简便实用的植物总DNA提取方法[J].山西大学学报，2000，23(3): 27139.［8］黄丰, 周联等.植物中药材总DNA提取方法比较[J].中药新药与临床理,1999 ,10(1): 1814.［11］李思光，罗玉萍, 陈万秋等.猕猴桃基因组DNA的提取及其RAPD扩增研究[J].南昌大学学报，2001，25(3):264–268.
第四篇：dna提取原理
dna提取原理
1． 溶液I—溶菌液：
溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2．溶液II－
NaOH－SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。
3.溶液III—
3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
4．为什么用无水乙醇沉淀DNA？ 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。5．在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？ 在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。
6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？ 加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。
7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？ 在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳
酚氯仿法提取DNA的原理
用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？
使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了DNase的降解作用。
缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。
氯仿的作用？
氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）
用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？
用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
(1).浓盐法
利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯 纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.（2）.阴离子去污剂法:
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA.（3）.苯酚抽提法:
苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态.（4）.水抽提法:
利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ٠80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS
DNA 提取是植物分子生物学研究的基础技术。目前,已经发展了多种方法,成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出DNA。但是有些情况下,不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异,在提取基因组DNA 时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理[1]。从富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质的木本植物中提取的方法难度就相对大于大多数的禾谷类及蔬菜类植物。从这些植物中分离出的DNA 由于多酚被氧化成棕褐色,多糖、单宁等物质与DNA 会结合成粘稠的胶状物,获得的DNA 常出现产量低、质量差、易降解,影响了
DNA 质量和纯度,不能被限制性内切酶酶切,严重的甚至不能作为模板进行PCR 扩增。针对这一现象,已有许多学者对植物特别是顽拗型木本植物的基因组DNA 提取纯化进行了改良和发展。笔者就植物DNA 提取各个环节,如样本的采集与保存、提取缓冲液成分的作用、DNA 提取纯化方法等进行归纳,同时对DNA 提取过程中的常见问题、原因及应对策略作简要的分析。植物样品的采集与保存
植物组织材料的采集与保存对提取DNA 的产量和质量有很大影响。通常应尽可能采集新鲜、幼嫩的组织材料,采集的过程中应尽可能使组织材料保持水分,在取样时立即用浸湿的纱布包裹采集的组织材料,放置在密闭的冰盒中,这样可使组织材料3～5 d 仍然保持新鲜。野外远距离采集样本时,在可能的条件下冷冻保存(如放置于液氮中);当不具备冷冻条件时, 最好用盛有无水CaSO4 的瓶子分别保存, 使其迅速干燥, 这种方法可将材料保存数月,返回后应尽快进行DNA 的提取工作。对具有大量次生代谢物(如丹宁、酚类、醌类等)的植物材料, 应尽可能采集幼嫩组织外, 最好进行冷冻保存并在短时间内进行DNA 提取。植物组织材料的化学保存法,如乙醇、丙二醇处理法,通常会导致DNA 剧烈降解, 因此,不作为推荐的保存方法[2]。对于采集回来的样品如要长期保存,应经液氮处理后贮存在-80 ℃冰箱或直接储放于液氮中,且在与提取缓冲液接触前,应防止冰冻的样品在空气中融化,否则酚类易被氧化。提取缓冲液
随着现代分子生物学的发展, DNA 分离技术也层出不穷, DNA 已经可以从诸如化石、木乃伊等极端材料中分离出来, 也可以从痕量材料获得DNA。无论是什么材料, 针对不同的来源和特点, 调整设计相应的提取缓冲液及不同的技术方案是十分重要的。在实际应用中可针对不同的情况对具体实验方案的各个部分进行不同组合。缓冲液的成分应根据分离对象的不同而变化,缓冲液的pH值、保护剂和表面活性剂都要根据不同样品进行优化。十二烷基磺酸钠(SDS)是一种阳离子强表面活性剂, 通常与蛋白酶K和抗氧化剂、螯合剂一起使用;而十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)是一种在高盐下能与核酸结合形成可溶、稳定的复合物, 低盐浓度下可沉淀的表面活性剂。乙二胺四乙酸(EDTA)可用于抑制金属离子依赖性的酶(螯合Mg2+、Ca2+)的活性。牛血清白蛋白(BSA)可使一些降解酶的表面变性。还原型巯基成分如 β2巯基乙醇、谷胱苷肽、半胱氨酸、二硫苏糖醇等一些硫醇类物质,通常可用于保护DNA 免受醌类物质、二硫化物、多酚氧化酶等物质的损害。加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)也可减少酚类、醌类及丹宁类物质的影响。还有其他一些非通用添加物,如抗坏血酸、维生素C 可用于降低醌类物质的影响, 精胺及其他多胺可用于降低核酶的影响,氰化物可用于降低重金属氧化酶的影响。另外还有在提取液中加入活性炭、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、重过亚硫酸钠、硼砂等物质防止多酚类物质氧化的报道[3核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。经离心弃上清后,CTAB蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全,离心后除去沉淀;上清液中的 DNA 用酚/ 氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS 法操作简单,温和,也可提取到高分子量的DNA ,但所得到的产物含糖类杂质较多。基因组DNA 经典的提取方法由于无需昂贵仪器和药品,提取的DNA 纯度能够满足一般分子生物学的需要,一直作为DNA 提取的常规方法。但这种方法操作步骤复杂,耗时长,易交叉污染,残留在DNA 溶液中有机物质对DNA 聚合酶有抑制作用。另外,酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染,有损操作者健康,因此使该方法的应用受到一定的局限性。
3.2 DNA提取新方法
近年来出现了以螯合树脂、特异性 DNA 吸附膜、离子交换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基础 DNA 提取新方法。这些方法主要应用于提取病毒、微生物、人和动物细胞、包埋组织样品、古生物标本及土壤环境样品 DNA[5]。已有多篇利用纯化柱和玻璃粉纯化植物基因组 DNA 的报道。马小军等将CTAB 液提取和氯仿抽提两步的上清液直接通过Wizard 纯化系统纯化得到的DNA ,RAPD 扩增效果良好,产率达2 250μg/ g[6]。张博等用硅珠(SiO2)颗粒吸附DNA 纯化方法,从不同树木叶片中均得到了高质量的 DNA 样品[7]。黄椰林等对常规CTAB 法提取的DNA 用玻璃粉悬浮液纯化,所获DN 的APCR 产物能直接测序,比较适用于富含黏多糖、单宁、多酚和萜类化合物等次生代谢物的植物样品和长期保存的标本材料[8]。袁长春等也用玻璃粉吸附法从富含酚类的茶类植物中提取纯净的总DNA[9]。目前国内外开发了多种商品化的DNA 提取纯化试剂盒,其分离原理有的利用核酸的分子量差异,有的利用特异性膜与DNA 结合达到分离、回收的目的,如离子交换柱、磁珠等。这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法,操作简单、高效, DNA 质量较高,但价格昂贵,提取量少。著名的国外的试剂盒生产厂家有Sigma2Aldrich、Promega、Invitrogen、TaKaRa、Whatman 等,它们针对不同来源的材料如微生物、动物体液、血液和组织、植物、加工产品、转基因产品等开发出一系列的试剂盒。国内的生物公司发展迅速,如上海生工、北京天为、北京博奥等也开发了系列试剂盒,质量与国外厂家相当,价格较低。除此之外,由于核酸提取纯化试剂盒制作门槛低,还有大量的生物公司提供试剂盒产品,使用者一定要慎重选择。DNA 试剂盒经过了几十年的发展,已经不再局限于单纯的提取纯化,有些厂家推出了DNA 提取—扩增 PCR 试剂盒,将DNA 提取和PCR 扩增结合起来,极大的提高了工作效率,如Sigma2Aldrich 公司的Sigma’s Extract2N2Amp Plant PCR kit 等。另外,还有高通量的DNA 提取产品,如高通量组织细胞研磨仪MM301 ,在常温和冷冻条件下对硬性、中硬性、韧性、脆性及纤维材料的研磨破碎,每次处理样品的个数可以多达48 个甚至192 个。美国应用生物系统公司6100 型核酸提取仪,可用于RNA、DNA 的提取纯化,可自编程序, 可选预设的程序,具有严格的防交叉污染体系,可从不同来源的样品中同时提取96 个样品。DNA纯化及杂质去除 4.1 酚类杂质的去除
对植物中次生产物酚类物质的去除,普遍是在提取液中加入适量的抗氧化剂和螯合剂,防止多酚氧化褐变。在提取DNA 过程中加入巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽及抗坏血酸等巯基试剂,抑制氧化反应,避免褐化。在样品液氮研磨及提取缓冲液中加入高分子螯合剂PVP(聚乙烯吡咯烷酮)或PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)等能络合多酚和萜类物质离心或氯仿抽提出去,有效的防止多酚物质氧化成醌类,避免溶液变褐而具有抗氧化作用。因此在提取液中加入适量的PVP 或PVPP 能提高DNA 的纯度),其用量视杂质的多少而定(1 %～6 %),PVP 同时能有效去除多糖。因此将PVP 和巯基乙醇配合使用并调整用量,能够有效地防止多酚污染。王玉成等认为以上的方法仅对褐化现象较轻者有效,却很难克服一些含酚类化合物丰富的植物,如柽柳、冷杉等树种的褐化。在CTAB 缓冲液加入一定量的硼砂(提取缓冲液含0.012 5 mol/ L 硼砂、2 % CTAB、1.4 mol/ L NaCl、巯基乙醇0.1 mol/ L ,pH值为9.0)提取柽柳、冷杉的RNA 取得了良好的效果,而且在提取紫丁香、糖槭、旱柳等植物组织的RNA 时也从未发生褐化[10]。
4.2 多糖类杂质的去除
多糖的污染是提取植物DNA 时常遇到的另一棘手的问题[11]。植物组织中往往富含多糖, 而多糖的许多理化性质与DNA 很相似,因此很难将它们分开。经典的CsCl 梯度离心能有效的除去植物中多糖,但梯度离心设备昂贵,操作不便且DNA 得率很低。近年国内外有一些去除多糖的相关报道,Dellaporta 等认为加入高浓度的 KAc 有利于除去多糖[12];Fang 等认为在1.0～2.5 mol/ L NaCl 的高盐TE 中,用无水乙醇沉淀DNA 能除去多糖[13];Sue Porebski 等在沉淀粗提DNA 时,将NaCl 的浓度提高至2.5 mol/ L 以除去多糖[14];Candelario 等通过调节材料的取样时期、使用量, 在氯仿处理后加含2 %CTAB 的分离缓冲液, 及延长离心时间等方法来有效去除仙人掌植物的多糖[15];徐志祥等将DNA 沉淀重悬于30 %乙醇中4 ℃放置过夜,离心, 上清加乙醇至80 %重新沉淀DNA ,能去除多糖和其他杂质[16];陈大明等利用活细胞中由于细胞区室化多酚类以及其他杂质与DNA 相互隔离的特性,在裂解细胞前用不含 CTAB 的提取缓冲液(0.14 mol/ L 葡萄糖、3 %可溶性PVP、10 mmol/ Lβ2巯基乙醇)去除细胞质中大多数生化成分,同时有效地防止多酚类物质被氧化,从而达到排除多酚类等杂质干扰的目的[17];程运江等先用水饱、乙醚和1.2～1.5 mol/ L Na2 Cl 溶液将大部分多糖去除, 再用2 倍乙醇沉淀DNA 可大大提高效率[18]。An Michiels 等用生长2～4 月的幼苗转移到暗室暗化处理4 周的黄化叶提取DNA 有效地防止多糖污染,同时发现在25 ℃异丙醇过夜沉淀DNA 能减少杂质污染且大大提高产率[19]。关于提取DNA 中蛋白质、糖类、多酚等各种杂质对分子生物学后续试验的影响,马小军等和文晓鹏等认为在一定范围内DNA 样品中蛋白质含量的高低, 可能不是影响PCR 扩增的重要因素, 去除RNA 后尚未纯化的DNA 作为模板进行RAPD 扩增也能得到和纯化后一致的条带。但是, 用EcoRI 和HindIII 检测表明, 未纯化的DNA 不能用于酶切[20-21]。目前检测DNA 的纯度最常用的方法是测定DNA 在230、260、280 nm的吸收值, 通过计算OD 260/ OD 280 来评价DNA 的纯度, 通常认为OD 260/ OD 280 在1.8～2.0 表明 DNA 的纯度较好。尽管这种方法用得很普遍,但并不可靠, 因为核酸在260 nm处的吸收很强,只有存在高水平蛋白质杂质时才会引起这2 个波长下吸收值的比值发生明显改变[22]。检测DNA 纯度最佳的办法是采用EcoRI、HindIII 等限制性核酸内切酶对DNA 进行酶切消化,只有能被酶切完全并可用作PCR 模板的基因组DNA ,才能证明其纯度高,所含蛋白质、多糖类等杂质少,才能进一步用于AFLP、RFLP、Southern 杂交等分子生物学的研究。5 展望
快速、经济地从植物样品中提取高产量、高纯度的基因组DNA 已成为植物分子生物学研究的首要问题。今后,基因组DNA 提取方法研究的发展将趋于用非有机溶剂提取法替代传统的有机溶剂提取;实现一步提取法,省去繁琐的提取和多次离心过程,更适于批量操作;利用物理吸附法,操作简便、提取效率高、对基因组DNA 没有损伤作用,适宜于自动化操作;提取过程自动化,把基因组DNA 的提取与其他分子生物学技术(毛细细管电脉,PCR ,基因芯片技术等)结合起来,实现从样品处理到基因分析过程的全部自动化操作。
第五篇：DNA提取方法
各种DNA提取方法 一，基因组DNA提取方法
制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等 试验步骤：
1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。
2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。
3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。
4、加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀，50℃水浴3h
5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相
6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL混匀，冰浴，10min.。7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。2500rpm离心10min。弃上清。
8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。9、12000r/min室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。二，外周血DNA提取技术 分离外周血白细胞提取方法： 试验步骤：
1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。
2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml 离心管中。
3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。4、2500rpm离心10min，弃上清。
5、加入10ml 溶血液，摇匀，冰浴15min。6、3000rpm离心10min，弃上清。
7、倒置离心管，去掉残液。
8、得白细胞，－80℃冻存。试验要求：
血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。
三，氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA： 试验试剂： Ligsisbuffer：
133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。ACD抗凝剂：__________柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。提取缓冲液（Extractionbuffer）：10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加
灭去离子水至100ml，高压灭菌 试验步骤：
1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。
2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。
3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。
4、加入8μl 的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。
5、每管加入450μl 饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。
6、取上清，每管加入250μl 饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。
7、取上清，每管加入500μl 氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。
8、取上清，每管加50μl 的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。
9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。
10、加入50μl 灭菌去离子水，转弹，混匀。四，NaI提取法提取外周血白细胞基因组： 实验步骤：
1、取外周抗凝血（全血）100ul 于eppendorf管中，12000rpm离心12min。
2、弃上清，加双蒸水200ul 溶解，摇匀20s。
3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。
4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。
5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。
6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。
7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。
五，常用的外周血白细胞基因提取方法： 试验原理：
苯酚/氯仿提取DNA是利用岘_Q______酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA 从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl 存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。试验步骤：
1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml 离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。
2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml 蛋白酶K0.2ml 至终浓度为100-200ug/ml 上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。
3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿﹕异戊醇（24﹕1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。
4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml 离心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul 溶解DNA置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。六，真核细胞DNA的制备
一般真核细胞基因组DNA 有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：
1、防止和抑制DNase对DNA的降解。
2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。试剂准备：
1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。
2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。
3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。4、20%SDS 5、2mg/ml 蛋白酶K
6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿
7、无水乙醇、75%乙醇 试验步骤： 材料处理：
1、新鲜或冰冻组织处理：
1)取组织块0.3-0.5cm3剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。2)将匀浆液转移到1.5ml 离心管中。
3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。4)60 C水浴1-3hr。
2、培养细胞处理：
1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。2)离心4000g 5min，去除上清液。3)加10倍体积的裂解缓冲液。4)50-55 C水浴1-2hr。DNA提取：
1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。
2、离心5000g 10min，取上层水相到另一1.5ml 离心管中。
3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g 10min，取上层水相到另一管中。
4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g 10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。
5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g 10min，取上层水相到另一管中。
6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。
7、待絮状物出现后，离心5000g 5min，弃上清液。
8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g 3min，弃上清液。
9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。七，细菌DNA的提取方法 针对一些不易于提取的细菌的方法: 试验试剂：
抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl 10MliCl
2MliCl
DEPC-water（抑制RNA酶活性）
3MNaAc(pH5.2)
96%乙醇
70%乙醇 试验步骤：
1、抽提缓冲液65℃预热__________。
2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。
3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12000rpm，离心10min。
4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12000rpm，离心10min。
5、重复再作一次步骤4。
6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。
7、以2000rpm，离心10min。
8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。
十，较为常用的细菌DNA提取方法： 实验步骤：
1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。
2、取1.5ml 培养物12000rpm离心2min。
3、沉淀中加入567ul 的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul 的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.4、加入100ul5mol/LNaCl 充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl 溶液，混匀后再65℃温育10min。
5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。
6、沉淀用1ml 的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇． 十一，真菌DNA提取总结的两种方法： 第一种方法： 试验步骤：
1、取真菌菌丝0.5g在液氮中迅速研磨成粉。
2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。
3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。
4、以4℃，1000rpm，离心5min。
5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10000rpm，离心5min。
6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀混匀静置约30min。
7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀用75%乙醇反复漂洗数次再用无水乙醇漂洗1次吹干，重悬于500ulTE中。
8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。
9、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10000rpm，离心5min。
10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc2.5 倍体积的无水乙醇-70℃沉淀30min以上。
11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干溶于200ulTE中，-20℃保存备用。DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。第二种方法： 试验步骤：
1、真菌菌丝0.5-1g在液氮中迅速研磨成粉。
2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min期间混匀2-3次。
3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。
4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10000rpm，4℃离心5min）。
5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇混匀静置约30min。
6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀用75%乙醇反复漂洗数次再用无水乙醇漂洗1次吹干，重悬于500ulTE中。
7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。
8、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10000rpm，离心5min。
9、取上清，1/10V3MNaAc2.5V体积的无水乙醇-70℃沉淀30min以上。
10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干溶于200ulTE中，-20℃保存备用。十二，石蜡包埋DNA提取试验方法 试验原理：
从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。Goelz 等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。Dubeau 等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消
化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。试验试剂：
配方：3mol/lNacl，0.3M柠檬酸三钠 2H2O，用HCL调PH值至7。0石蜡消化液：150nmol/lNacL：15mmol/l 柠檬酸钠，1%SDS，PH7.0。
试验步骤：
1、取蜡块切片15-20张（8μm），置于eppendorf管中，加入1ml 的二甲苯，37℃作用3h，以10000rpm，离心3min，倾去二甲苯。重复3-4次，观察管壁是否光滑。如果仍有蜡质残存，需继续脱蜡。
2、剃度酒精水化：加入100%乙醇1ml，室温下放置30min，以10000rpm离心3min，去上清；再依次分别加入95%；75%；50%的乙醇重复上面的步骤。
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