第一篇：单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备
摘 要:单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。下面主要讲述制备单抗的实验过程。
关键词：抗体，单克隆，肿瘤，细胞融合，淋巴细胞
现代生物技术制药工业始于1971年，现已创造出35个重要治疗药物，全球大约有2500多家公司，主要产品有重组蛋白质药品、重组疫苗和诊断、治疗用的单克隆机体三大类。我国自80年代在采用现代生物技术改造传统生物技术制药产业方面已取得初步成果。但我国生物技术诊断试剂、酶工程、动植物细胞工程医药产品、现代生物技术支撑技术、后处理技术和制剂技术等方面与国外还存在差距。
1．国外现代生物技术产业发展的现状
自1971年Cetus公司成立至今，现代生物技术制药工业已走完了二十五年的路程，创造出35个重要的治疗药物，目前已在治疗癌症、多发性硬化症、贫血、发育不良，糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传性疾病中取得良好效果。在医药工业中，传统生物技术（包括近代生物技术）已为人类提供了许多重要药品，在保障人类生命健康和推动社会进步中发挥了巨大作用；现代生物技术以其特有的高新技术又为人类提供了传统生物技术难以获得的极微量的珍贵药品。由于这一系列现代生物技术新型药物的出现，使过去无法治疗的疑难疾病得到了治疗。同时，应用现代生物技术DNA重组，细胞融合以及细胞大规模培养等现代生物技术发展和提高传统生物技术的生产水平，为抗生素、氨基酸、维生素以及基体激素等药品的生产，构建了高产新菌株，创造新工艺，提高生产能力，降低生产成本，促进生产发展。
2．我国现代生物技术医药产业发展的现状
现代生物技术医药产业化进程：我国自80年代开始进行现代生物技术药品的研究和开发，虽然起步较晚，基础较差，但一开始就受到党和国家的高度重视，并列为“863”计划和国家重点攻关项目的主要内容，经过十多年的努力，特别是近五年来，现代生物技术医药产业有了突破性的进展，到1998年7月底我国已有十四种现代生物技术药品和疫苗投入生产，据初步统计，1997年的工业总产值约20亿（包括采用现代生物技术改造传统生物技术后新增加的产值在内）。
目前我国己有近200多个现代生物技术制药企业，其中约30家生产企业已具有不同规模的生产能力，陆续投入生产。因此，可以说我国现代生物技术制药产业化已经开始。
3.单克隆抗体
3.1单克隆抗体的概念
抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
3.1单克隆抗体的主要特点
1)由于来于单克隆细胞，所分泌的抗体分子在结构上高度均一，甚至在氨基酸序列及空间构型上均相同；
2）由于抗体识别的是抗体分子上单一抗原位区，且所有抗体分子均相同，由此，单克隆抗体具有高度特异性； 3）产生该抗体的为一无性细胞系，且可长期传代并保存，为此可持续稳定的生产同一性质的抗体。
3.2单克隆抗体的应用
作为亲合层析的配体:单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。
作为生物治疗的导向武器:脂质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。如热敏免疫脂质体，由抗人乳癌细胞抗体经疏水长链脂肪酸修饰，抗体带上长的疏水碳链，部分插入脂质体的脂双层膜中，抗体Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗体活性。热敏免疫脂质体可特异识别靶细胞(人乳癌细胞)，并通过相变温度引起脂质体破裂，从而定向释放药物。另外，可将化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等细胞毒剂与抗肿瘤抗原的单克隆抗体直接交联，利用其导向作用，使细胞毒剂定位于肿瘤细胞把它直接杀伤。这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。如应用抗T细胞单抗和柔红霉素结合物，在体外对非T淋巴细胞就无杀伤作用。但是，要把这种方法应用于临床，目前还存在不少技术难关，包括人体对鼠源单抗的排异问题等。
作为免疫抑制剂:抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。
作为研究工作中的探针:单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位(即抗原决定簇)相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。
增强抗原的免疫原性:抗体对抗原免疫原性的增强作用由来已久，60年代就已发现幼猪对破伤风类毒素难以产生抗体，注射相应特异性抗体IgG，就能有效地提高对委内瑞拉马脑炎病毒的免疫应答。1984年以来，Celis等发现，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖，并可诱生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的HBs抗原不产生免疫反应时，加入抗HBs抗体组成的复合物，则可有效地诱生免疫反应。根据这一作用，现已研制出乙肝的抗原—抗体复合物型治疗性疫苗。
作为医学检验试剂:单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原—抗体反应的特异性，减少了和其它物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性，使抗原—抗体区应结果便于控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下：(1)诊断各类病原体
这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。
(2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测
用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。
随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已经建立，这为肿瘤的早期诊断及其阐明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗可用于体内诊断，再结合X-线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。(3)检测淋巴细胞表面标志 用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。例如检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容，应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。
(4)机体微量成分的测定
应用单抗结合其它技术，可对机体的多种微量成分进行测定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性而建立起来的方法，它可以测至10-9～10-12g，使原来难以测定的激素能够进行定量分析。除了激素，还可检测诸多酶类、维生素、药物和其它生化物质。这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义.4实验方法
4.1材料
a．盐溶液：将NaCl8克，KClO4克，Na2HPO4·2H2O1.77克，NaH2P04·H
2O0．69克，葡萄糖2克，酚红0.001克，溶于1000ml双蒸水中，pH7.2。高压115℃，15分钟，保存于室温。
标准培养液；RPMI1640，DMEM或者Iscove‘s培养液，加入10％灭活血清(马血清、小牛血清或胎牛血清)，贮存于4℃。在使用前加入2％100×谷酰胺，1％100×丙酮酸钠，1％100 ×抗菌素(青霉素和链霉素各10000单位／m1)，0.05％0.1M硫乙二醇。所有培养液均需于两天内用完。选择性培养液：即所谓HAT培养液，100× HAT培养液，100×H：Hypoxanthine次黄嘌呤为10mM，必须在45℃溶解完全。100×A：Aminopterine氨基喋呤为0.04mM．必须在45℃溶解于稀释NaOH溶液中，然后再用HCI中和。
I00×T；Thymidime胸腺嘧啶，1.6mM，在室温中溶解。然后各溶液分别除菌过滤，分装5m1一支，-20℃保存。
HAT和HT的营养液都必须在应用前配制，方法把100×贮存液按1％加入营养液即成。
细胞冻存液：为9份营养浓加入l份DMSO二甲基亚砜，混匀。此时细胞株必须生长良好[1]。b、骨髓瘤细胞株
BALB／c小鼠骨髓瘤细胞株，经过克隆纯化P3×63Ag8(简称×63)和其衍生株SP—2／0，SP—2／0不产生球蛋白，此两株细胞均为本研究所Dr、G、Kohler所培育，这些细胞株都适应于各种标准培养液以及2.5cm2和7.5cm2的塑料培养瓶，分别装入4ml或12ml营养液，通入气体为10％CO 2、7％O2和83％N2，37℃恒温培养。
4.2 方法
a、小鼠免疫
成年BALB／c小鼠各种性别均可，用流感病毒1000个血凝单位腹腔注射，作为首次免疫。7一12周后，再给200血凝单位病毒腹腔注射，作为加强免疫。
在加强免疫后4—5天，即可进行细胞融合，处死小鼠、无菌取脾，把脾细胞轻轻压入10m1的盐溶液中，然后把细胞悬浮液转入15ml离心管中，毛细管吹打，然后至室温中10分钟，让其自然下沉，吸出大约9ml上清液，不要搅动底下的沉淀块，然后用TURK溶液作白细胞计数。b、腹腔内巨噬细胞的采取
把成年BALB／c小鼠处死，剥开腹部皮肤，用4—5ml的标准培养液或0.34M(＝11.6％)的蔗糖溶液注入腹腔，用18号针头从耻骨联合处，直接插入，把针头朝向肝右叶上方，然后轻轻按摩腹部，再行吸出腹腔液体。每鼠可得1.5—3×105的巨噬细胞，这些细胞可收集于塑料管中，用任何一种标准培养液洗细胞，并于30分钟内用完。c、大孔培养
24孔培养板，每孔可容2m1培养液，培养于37℃，含7%CO2/DA大气恒温箱中。湿度为85—95％。
换营养液时，分别以无菌巴氏吸管联接于吸引装置上，吸出大约lml的血营养液，然后用一个小口的25m1吸管，分别加入预热的新鲜营养液。
如果细胞长得很密，可以用2ml吸管吸出培养液，转种于小瓶中，一般1.5ml细胞悬浮液可接种25㎝2的小瓶，当小瓶中细胞长至单层时，即可转种至75cm2的瓶中。以后即可按转种骨髓瘤细胞的方法，维持杂交瘤细胞。d、微量培养法平底的微量培养板每孔可容纳0.25mI的培养液，细胞培养条件与24孔培养板相同。当细胞长待很密时，第一步可转入24孔培养板的二个孔中，加入1m1培养液，然后按24孔培养板处理。
5.结论
通过小鼠免疫培养，腹腔内巨噬细胞的采取，微量培养，大孔培养，可得到一定量的杂交瘤细胞，同时分析了实验的一些影响因素，结果如下。
（1）.各次细胞融合结果的差别，只有在巨噬细胞活跃的培养孔中，才能得到抗体阳性的杂交瘤细胞克隆。
（2）.巨噬细胞对杂交细胞的作用，不加巨噬细胞，没有杂交单克隆细胞，加入巨噬细胞，结果大大增加。
（3）.加入巨噬细胞的用量和时间，投入实验的脾细胞的量减少10倍，培养28天后，活细胞多于10的阳性孔。
（4）.用不同动物巨噬细胞作为喂养细胞，巨噬细胞来源于何种品系的动物并不重要，来自不同种动物的腹腔洗液，或者杂交动物的小鼠、甚至大鼠或豚鼠的巨噬细胞都可促使杂交瘤细胞生长
（5）.限量脾细胞杂交试验可知脾细胞加入量为4×106时，结果较好，细胞融合数较多。
（6）.骨髓瘤细胞株的比较中，选择合适的骨髓瘤细胞株（x63），产生单克隆抗体的几率较高，但不是都产生同一种抗体的。
（7）.融合剂 PEG聚乙二醇的比较中，所有低分子的PEG结果都差，其中有些是明显有毒性反应，但分子量太大阳性数也会有所下降。
（8）.细胞融合温度的比较中，室温比常规的4℃和0℃往往结果较理想。
（9）.各种营养液的比较，DMEM、RPMI、Iscove` s三种营养液都可得到较多的杂交细胞株，而对Iscove` s营养液比其他培养液要更好些。
（10）.不同细胞换液方案比较中，细胞融合物直接接种于HAT培养液中为优。
（11）.在微量培养板上作杂交瘤细胞株选择培养，可知微量孔培养的杂交细胞数常多于常规培养孔。
4（12）.在无血清培养液中，所有的杂交瘤细胞克隆只在Iscovs`s完全培养液中才能生长旺盛。
参考文献
[1]齐香君，现代生物制药工艺学[M]，化学工业出版社，2003.9 [2]甄永苏等，抗体工程药物[M]，化学工业出版社，2002.5 [3]李元等，现代工程药物[M]，化学工业出版社，2002.5 [4]张和君，单克隆抗体细胞免疫反应技术[M]，云南科技出版社，1985.2 [5]胡春艳，刘全忠． 单克隆抗体制备技术及应用的研究进展［J］．
安徽预防医学杂志，2008，14(2):116-118．
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［J］． 生物技术通讯，2007，18(3):476-479．
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肃科技，2005，21(3):108-109．
［10］郭长占． 转基因小鼠研究进展［J］． 中华微生物学和免疫学杂
志，2000，20(3):278-282．
［11］刘瑞振，张长弓，何琼，等． 抗人DcR3单克隆抗体的制备鉴定
及应用［J］． 免疫学杂志，2009，25(1):34-38．
第二篇：7单克隆抗体制备教案
单克隆抗体的制备
一、教学目标
知识目标：
1、单克隆抗体的概念
2、单克隆抗体的制备过程，以及过程中涉及的具体筛选过程。
3、单克隆抗体的应用，和普通抗体相比的优点。能力目标：
1、学会从复杂的制备过程中找出简单的流程图
2、注意前后知识点的对比学习。情感态度价值观：从生物导弹的应用了解单克隆抗体目前在抗癌方面的贡献，并努力掌握更多的相关知识。
二、教学的重点难点：
单克隆抗体的制备过程，以及过程中涉及的具体筛选过程。
三、教学课时：1课时
四、教学过程：
【一】锚式问题：从“生物导弹”一个新颖而又陌生的画面入手。引发学生的探究热情。具体结合材料和图片来介绍生物导弹。资料：“生物导弹”是免疫导向药物的形象称呼，它由单克隆抗体与药物或放射性同位素配合而成，因带有单克隆抗体而能自动导向，在生物体内与特定目标细胞或组织结合，并由其携带的药物产生治疗作用。问题：生物导弹中的关键成分是什么？什么是单克隆抗体？ 【二】自主探究（4分钟，学生看课本完成）
1、长期人们怎样获得抗体？这样的抗体有什么缺点？
（给动物反复注射抗原，然后在动物的血清中提取抗体。抗体产量低、纯度低、特异性差）
2、B淋巴细胞在分泌抗体时有什么特点？B淋巴细胞实际指的是什么细胞？（一个或是一种B淋巴细胞只能分泌一种抗体；效应B细胞或是浆细胞）
分析：这两个问题比较简单，而且在课本中能直接找到答案，学生迅速阅读课本就能完成。【三】继续探究（10分钟，学生看课本，查阅资料，讨论合作完成）
1、写出单克隆抗体制备的过程简图（略，见课件）
2、怎么获得免疫小鼠，目的是什么？
（给小鼠注射特定的抗原，使小鼠发生特定的体液免疫，产生相应的B淋巴细胞）
3、为何选择B淋巴细胞和骨髓瘤细胞？
（B淋巴细胞能产生特定的抗体，单不能无限增殖；骨髓瘤细胞能无限增殖）
4、过程中大致需要几次筛选？怎么筛选？目的是什么？（主要是2次。第一次为了筛选出杂交瘤细胞；第二次筛选出能大量产生特定抗体的杂交瘤细胞。）
5、最终获得单克隆抗体的办法有几种？分别是？
（两种。体内在小鼠的腹水中提取；体外在细胞的培养液中提取）
6、单克隆抗体制备过程涉及的技术及其原理有哪些？
（细胞融合：原理是细胞膜具有流动性；动物细胞培养原理：细胞增殖）
分析：上述的6个问题涉及的内容是本节课的重点和难点，也是考点，需要和学生一起系统化的梳理，并强调重点内容作好笔记。【四】继续探究总结
1、单克隆抗体的“单”和“克隆”分别指的是什么？
（单：单个能产生大量抗体的杂交瘤细胞；克隆：无性繁殖即有丝分裂）
2、单克隆抗体的应用主要有哪些？
（主要集中在医学方面，诊断疾病，治疗疾病等）
3、单克隆抗体的主要优点有哪些？
（特异性强、灵敏度高、纯度大、可大量制备）【五】运用质疑
1、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是(A)A．经过免疫的B淋巴细胞 B．不经过免疫的T淋巴细胞 C．经过免疫的T淋巴细胞 D．不经过免疫的B淋巴细胞
2、将小鼠骨髓瘤细胞与一种B淋巴细胞融合，可使融合的细胞经培养产生单克隆抗体，下列说法中不正确的是(C)A．动物细胞融合和动物细胞培养技术是单克隆抗体技术的基础 B．实验中杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖的方式是主动运输
C．B淋巴细胞与骨髓瘤细胞直接放入培养液中就能融合为杂交瘤细胞
D．按照培养基的用途分类，实验中筛选杂交瘤细胞的培养基是选择培养基
6、单克隆抗体是指（C）
A．单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体
B．单个B淋巴细胞增殖产生的抗体 C．单个杂交瘤细胞增殖产生的抗体
D．单个抗体通过克隆化，产生大量抗体 【六】课外延伸
单克隆抗体是来自谁？如果直接给人注射，会有什么反应？请同学想办法来解决！！
第三篇：单克隆抗体的制备及特点
单克隆抗体
一、单克性抗体的制备
1、免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生效应B淋巴细胞的过程。
2、将准备好的骨髓瘤细胞与效应B淋巴细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇或灭活的病毒。在聚乙二醇或灭活的病毒作用下，各种效应B淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养 选择性培养的目的是筛杂交瘤细胞。在选择性培养基上未融合的骨髓瘤细胞、未融合的淋巴细胞，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞才能在选择性培养基存活，杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌特异性抗体
4、杂交瘤细胞的克隆化培养和抗体阳性检测。选择性培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。
5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内培养法和体外培养法。
(1)体内培养法；用注射器抽取腹水，从中可获得大量单克隆抗体。(2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。从培养液中获取所需要的单克隆抗体。
二、单克性抗体的特点
特异性强、灵敏度高、能大量制备
三、杂交瘤细胞的特点
杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌特异性抗体
四、单克隆抗体制备过程中有三个筛选过程
1、从脾脏中筛选出多种效应B细胞。
2、在特定的培养基中筛选杂交瘤细胞
3、进行克隆化培养和抗体阳性检测，筛选出能产生特定抗体并能无限增殖的杂交瘤细胞。
五、单克隆抗体应用的基本原理是：抗原——抗体的的特异性结合。
六、单克隆抗体的主要应用
1、作为诊断试剂：单克隆抗体最广泛的应用就是作为诊断试剂。由于单克隆抗体纯度高、特异强，能准确地识别抗原物质的细微差别，并能与一定抗原特异性结合。
2、用于治疗疾病和运载药物。把抗癌细胞的单克隆抗体放射性同位素、化学药物或细胞毒素结合制成生物导弹。利用抗原——抗体的的特异性结合，借助单克隆抗体的导向作用，能将药物定向带到癌细胞所在部位，在原位杀死癌细胞，不损伤正常细胞、药剂量少、疗效高、毒副作用小。
第四篇：单克隆抗体的制备论文 (自动保存的)
摘 要
单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。本文主要讲述制备单抗的实验过程，并对实验结果及其影响因素进行分析。
关键词：抗体，单克隆，肿瘤，细胞融合，淋巴细胞
Abstract
The monoclonal antibody technology is the modern life sciences research important tool, has the indispensable function in the gene and the protein structure and the function research aspect.In recent years, along with the molecular biology technology's development, presented the embedment monoclonal antibody and by the transgene mouse, the bacteriophage demonstrated that the technology, the ribosome demonstrated the technology and the covalence demonstrated the technology produces monoclonal antibody.These technologies effective addressing monoclonal antibody questions and so on mouse source.This article mainly prepares Shan Kang the new technology to the above several kinds to make a summary and analysis of factors.Keywords:antibodi,monoclonal, neoplasms,cell fusion,lymphocyte
目录
1.前言....................................................................................................................4
1.1国外现代生物技术产业发展的现状............................................................4 1.2我国现代生物技术医药产业发展的现状.....................................................4 2.文献综述.............................................................................................................5
2.1单克隆抗体的概念.....................................................................................5 2.2单克隆抗体的主要特点..............................................................................5 2.3单克隆抗体的应用..................................................................................6 3实验方法.............................................................................................................9
3.1材料和方法：..........................................................................................9
3.1.1材料..............................................................................................9 3.1.2.方法............................................................................................10
4.结果与讨论.......................................................................................................11
4.1细胞融合结果的差别..............................................................................11 4.2巨噬细胞在培养杂交瘤细胞株的作用...................................................12
4.3加入巨噬细胞的用量和时间..................................................................13 4.4不同源的巨噬细胞.................................................................................14 4.5细胞加入的量.........................................................................................15 4.6骨髓瘤细胞株的比较..............................................................................16 4.7融合剂的比较.........................................................................................17 4.8细胞融合温度的比较..............................................................................18 4.9各种营养液的比较.................................................................................19 4.10细胞换液的方案...................................................................................20 4.11微量培养...............................................................................................20 4.12无血清培养液.......................................................................................21 5.结论..................................................................................................................22 6.参考文献..........................................................................................................24 7.致谢..................................................................................................................2
1.前言
现代生物技术制药工业始于1971年，现已创造出35个重要治疗药物，全球大约有2500多家公司，主要产品有重组蛋白质药品、重组疫苗和诊断、治疗用的单克隆机体三大类。我国自80年代在采用现代生物技术改造传统生物技术制药产业方面已取得初步成果。但我国生物技术诊断试剂、酶工程、动植物细胞工程医药产品、现代生物技术支撑技术、后处理技术和制剂技术等方面与国外还存在差距。
1.1国外现代生物技术产业发展的现状
自1971年Cetus公司成立至今，现代生物技术制药工业已走完了二十五年的路程，创造出35个重要的治疗药物，目前已在治疗癌症、多发性硬化症、贫血、发育不良，糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传性疾病中取得良好效果。在医药工业中，传统生物技术（包括近代生物技术）已为人类提供了许多重要药品，在保障人类生命健康和推动社会进步中发挥了巨大作用；现代生物技术以其特有的高新技术又为人类提供了传统生物技术难以获得的极微量的珍贵药品。由于这一系列现代生物技术新型药物的出现，使过去无法治疗的疑难疾病得到了治疗。同时，应用现代生物技术DNA重组，细胞融合以及细胞大规模培养等现代生物技术发展和提高传统生物技术的生产水平，为抗生素、氨基酸、维生素以及基体激素等药品的生产，构建了高产新菌株，创造新工艺，提高生产能力，降低生产成本，促进生产发展。
1.2我国现代生物技术医药产业发展的现状
现代生物技术医药产业化进程：我国自80年代开始进行现代生物技术药品的研究和开发，虽然起步较晚，基础较差，但一开始就受到党和国家的高度重视，并列为“863”计划和国家重点攻关项目的主要内容，经过十多年的努力，特别是近五年来，现代生物技术医药产业有了突破性的进展，到1998年7月底我国已有十四种现代生物技术药品和疫苗投入生产，据初步统计，1997年的工业总产值约20亿（包括采用现代生物技术改造传统生物技术后新增加的产值在内）。目前我国己有近200多个现代生物技术制药企业，其中约30家生产企业已具有不同规模的生产能力，陆续投入生产。因此，可以说我国现代生物技术制药产业化已经开始。
本文主要介绍了单克隆抗体的制备过程及应用。
2.文献综述
2.1单克隆抗体的概念
抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
2.2单克隆抗体的主要特点
1)由于来于单克隆细胞，所分泌的抗体分子在结构上高度均一，甚至在氨基酸序列及空间构型上均相同；
2）由于抗体识别的是抗体分子上单一抗原位区，且所有抗体分子均相同，由此，单克隆抗体具有高度特异性；
3）产生该抗体的为一无性细胞系，且可长期传代并保存，为此可持续稳定的生产同一性质的抗体。2.3单克隆抗体的应用
作为亲合层析的配体:单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。
作为生物治疗的导向武器:脂质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。如热敏免疫脂质体，由抗人乳癌细胞抗体经疏水长链脂肪酸修饰，抗体带上长的疏水碳链，部分插入脂质体的脂双层膜中，抗体Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗体活性。热敏免疫脂质体可特异识别靶细胞(人乳癌细胞)，并通过相变温度引起脂质体破裂，从而定向释放药物。另外，可将化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等细胞毒剂与抗肿瘤抗原的单克隆抗体直接交联，利用其导向作用，使细胞毒剂定位于肿瘤细胞把它直接杀伤。这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。如应用抗T细胞单抗和柔红霉素结合物，在体外对非T淋巴细胞就无杀伤作用。但是，要把这种方法应用于临床，目前还存在不少技术难关，包括人体对鼠源单抗的排异问题等。
作为免疫抑制剂:抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。作为研究工作中的探针:单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位(即抗原决定簇)相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。
增强抗原的免疫原性:抗体对抗原免疫原性的增强作用由来已久，60年代就已发现幼猪对破伤风类毒素难以产生抗体，注射相应特异性抗体IgG，就能有效地提高对委内瑞拉马脑炎病毒的免疫应答。1984年以来，Celis等发现，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖，并可诱生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的HBs抗原不产生免疫反应时，加入抗HBs抗体组成的复合物，则可有效地诱生免疫反应。根据这一作用，现已研制出乙肝的抗原—抗体复合物型治疗性疫苗。
作为医学检验试剂:单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原—抗体反应的特异性，减少了和其它物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性，使抗原—抗体区应结果便于控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下：
(1)诊断各类病原体
这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。
(2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测
用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已经建立，这为肿瘤的早期诊断及其阐明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗可用于体内诊断，再结合X-线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。
(3)检测淋巴细胞表面标志
用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。例如检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容，应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。
(4)机体微量成分的测定
应用单抗结合其它技术，可对机体的多种微量成分进行测定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性而建立起来的方法，它可以测至10-9～10-12g，使原来难以测定的激素能够进行定量分析。除了激素，还可检测诸多酶类、维生素、药物和其它生化物质。这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义。3实验方法
3.1材料和方法：
3.1.1材料
a．盐溶液：将NaCl8克，KClO4克，Na2HPO4·2H2O1.77克，NaH2P04·H 692O0．克，葡萄糖2克，酚红0.001克，溶于1000ml双蒸水中，pH7.2。高压115℃，15分钟，保存于室温。
标准培养液；RPMI1640，DMEM或者Iscove„s培养液，加入10％灭活血清(马血清、小牛血清或胎牛血清)，贮存于4℃。在使用前加入2％100×谷酰胺，1％100×丙酮酸钠，1％100 ×抗菌素(青霉素和链霉素各10000单位／m1)，0.05％0.1M硫乙二醇。所有培养液均需于两天内用完。
选择性培养液：即所谓HAT培养液，100× HAT培养液，100×H：Hypoxanthine次黄嘌呤为10mM，必须在45℃溶解完全。100×A：Aminopterine氨基喋呤为0.04mM．必须在45℃溶解于稀释NaOH溶液中，然后再用HCI中和。
I00×T；Thymidime胸腺嘧啶，1.6mM，在室温中溶解。然后各溶液分别除菌过滤，分装5m1一支，-20℃保存。HAT和HT的营养液都必须在应用前配制，方法把100×贮存液按1％加入营养液即成。
细胞冻存液：为9份营养浓加入l份DMSO二甲基亚砜，混匀。此时细胞株必须生长良好[1]。b、骨髓瘤细胞株
BALB／c小鼠骨髓瘤细胞株，经过克隆纯化P3×63Ag8(简称×63)和其衍生株SP—2／0，SP—2／0不产生球蛋白，此两株细胞均为本研究所Dr、G、Kohler所培育，这些细胞株都适应于各种标准培养液以及2.5cm2和7.5cm2的塑料培养瓶，分别装入4ml或12ml营养液，通入气体为10％CO 2、7％O2和83％N2，37℃恒温培养。3.1.2.方法
a、小鼠免疫
成年BALB／c小鼠各种性别均可，用流感病毒1000个血凝单位腹腔注射，作为首次免疫。7一12周后，再给200血凝单位病毒腹腔注射，作为加强免疫。
在加强免疫后4—5天，即可进行细胞融合，处死小鼠、无菌取脾，把脾细胞轻轻压入10m1的盐溶液中，然后把细胞悬浮液转入15ml离心管中，毛细管吹打，然后至室温中10分钟，让其自然下沉，吸出大约9ml上清液，不要搅动底下的沉淀块，然后用TURK溶液作白细胞计数。
b、腹腔内巨噬细胞的采取
把成年BALB／c小鼠处死，剥开腹部皮肤，用4—5ml的标准培养液或0.34M(＝11.6％)的蔗糖溶液注入腹腔，用18号针头从耻骨联合处，直接插入，把针头朝向肝右叶上方，然后轻轻按摩腹部，再行吸出腹腔液体。每鼠可得1.5—3×105的巨噬细胞(m￠)，这些细胞可收集于塑料管中，用任何一种标准培养液洗细胞，并于30分钟内用完。c、大孔培养
24孔培养板，每孔可容2m1培养液，培养于37℃，含7%CO2/DA大气恒温箱中。湿度为85—95％。
换营养液时，分别以无菌巴氏吸管联接于吸引装置上，吸出大约lml的血营养液，然后用一个小口的25m1吸管，分别加入预热的新鲜营养液。
如果细胞长得很密，可以用2ml吸管吸出培养液，转种于小瓶中，一般1.5ml细胞悬浮液可接种25㎝2的小瓶，当小瓶中细胞长至单层时，即可转种至75cm2的瓶中。以后即可按转种骨髓瘤细胞的方法，维持杂交瘤细胞。d、微量培养法
平底的微量培养板每孔可容纳0.25mI的培养液，细胞培养条件与24孔培养板相同。当细胞长待很密时，第一步可转入24孔培养板的二个孔中，加入1m1培养液，然后按24孔培养板处理。
4.结果与讨论
通过体内单克隆抗体培养的到以下结果，下面是对细胞融合的实验结果进行的分析，并对实验数据进行讨论。
4.1细胞融合结果的差别
用5×107的BALB／c小鼠脾细胞与5×106骨髓瘤细胞进行融合，方法按Kohler和Milstein（1975，1976)的方法，每批细胞融合物分装到24个培养孔，培养28天，记录活细胞每孔多余104者为阳性，结果如表1所示。
表1 各次细胞融合结果的差别
实验
脾号
阳性
孔
数3／24
0／
20／
223／ 22
2／
8／
24／ 2
824／24 3
0／24＋0／24
0／24＋0
／
18／24＋2
／
1／24＋0
／
2表1中融合的结果波动很大，结果理想时，所有的培养孔可以都是阳性，而不理想时则为0，而唯一确实可靠的结论是：只有在巨噬细胞活跃的培养孔中，才能得到抗体阳性的杂交瘤细胞克隆。这些培养孔看起来十分清亮，在最初培养的第一周内，很少细胞碎片，而且这些巨噬细胞一直可存活到实验的结束。但巨噬细胞的存在并不是唯一的因素，在实验4、7、8和11中应用了每个培养孔加入1×104的巨噬细胞，获得理想结果，而相同地在实验3，12中也应用1×104巨噬细胞，结果却不理想。
4.2巨噬细胞在培养杂交瘤细胞株的作用
接下去一个实验，除了在实验的当天给每个培养孔加入2×104的巨噬细胞外，其他方面都按Kohler和Milstein的方案进行，结果见表2 细胞融合物的准备，接种和判定都按表1方法进行、本实验按表2所列于实验当天加入巨噬细胞。
表2 巨噬细胞对杂交细胞的作用
实验
脾号
阳性孔数
不加巨噬细胞
加巨噬细胞 2
2／24
24／24
8／23
21／24
24／24
24／24
24／24
24／24 4
0／24＋0／24
23／24
0／24＋0／24
24／24 11
18／24＋21／24
22／24 12
1／24＋0／24
24／24
由表2可得，巨噬细胞的效果十分明显，表现在相同的脾脏9和10，不加巨噬细胞，没有杂交单克隆细胞，加入巨噬细胞，结果大大增加。再如脾5，脾
6、脾12未加巨噬细胞时只有极少数杂交细胞克隆生长，而加入后几乎是90—100％都产生了杂交细胞的克隆。另外，在这个实验中，虽然脾12的细胞融合物在对照组中已加过了104巨噬细胞(参阅表1)但其效果并不理想，而当第二次加入另一个小鼠的巨噬细胞时，获得理想结果，说明前面的巨噬细胞是无效果的，为了避免遇上无效的巨噬细胞影响结果，应该合并3—4只小鼠的腹腔洗出的巨噬细胞，作为喂养细胞。
4.3加入巨噬细胞的用量和时间
可以将投入实验的脾细胞的量减少10倍，其他方法则按照K6hler和M11stein(1975，1976)的方法进行。不同剂量的巨噬细胞和不同时期加入的实验结果见表3。
表3 影响巨噬细胞的有关因素
加入日期
每孔加入巨噬细胞量
阳性孔数
0
33×103
43×104
5-0
0
0
0
0
0
1
0 21
0
1Ca
4
0
0
0
0
2合计
0
--
表3说明按照Kohler和Milstein(1975、1976)的方法，取一只BALB／c小鼠脾细胞5×106和骨留瘤细胞5×108进行融合。融合当天称为“0”天，每天收集小鼠腹腔巨噬细胞，并按各需要量加入培养孔，培养28天后，计算24个培养孔中，活细胞多于104的阳性孔[2]。
4.4不同源的巨噬细胞
巨噬细胞来源于何种品系的动物并不重要，来自不同种动物的腹腔洗液，或者杂交动物的小鼠、甚至大鼠或豚鼠的巨噬细胞都可促使杂交瘤细胞生长，结果如表4
表4 用不同动物巨噬细胞作为喂养细胞的比较
动物来源
每个培养孔加入巨噬细胞数
总阳性数
3×103
3×10
4105
小鼠BALB/c
52117
小鼠C57BL/6
小鼠C3H
0
321
小鼠Outbred(杂种)7
大鼠Rat
121
豚鼠Guinea pig
0
巨噬细胞来自各种动物如表4所列，每种动物各取了3只进行脸皮灌洗，合并其巨噬细胞在细胞融合前一天接种于各培养孔，第25天时计数24个培养孔的阳性数、(活细胞多于104者为阳性。)．
另外，还试验了已经建株的巨噬细胞系和在实验室中长期传代的巨噬细胞株，这些细胞都来自BALB／c小鼠。
4.5细胞加入的量
脾细胞参加细胞融合的用量，通过脾细胞限量试验可以得到结果，结果见表5。
表5 限量脾细胞杂交试验
实验
参加融合的脾细胞数
2×106
4×106
374 14
由表5可知4×106的脾细胞结果较好，细胞融合数较多。取BALB／c小鼠牌细胞，分别用下表所列的脾细胞量与5×106x 63骨朗瘤细胞融合，接种于24孔培养板中，细胞融合的前一天，每孔接种2×104腹腔巨噬细胞。培养24天后，每孔活细胞数多于104者为阳性孔。4.6骨髓瘤细胞株的比较
细胞融合时脾细胞和骨髓瘤细胞数如表6所列，接种于24孔塑料板，每孔并含2×104巨噬细胞，第28天记录活细胞数大于104者为阳性。
表6 骨髓瘤细胞株的比较
骨髓瘤细胞
参加融合的脾细胞数
总阳性孔
数
3×106
X63
3×106
107
3×107
237 Sp2/0
3×108
0
0107
0
43×107
表6说明，选择合适的骨髓瘤细胞株，产生克隆的几率较高，但不是都产生同一种抗体的。用骨髓瘤细胞x 63作为细胞融合的亲代细胞，后来产生的存活的杂交细胞抹，实际上都带有亲代骨髓细胞瘤细胞基因密码，因而各杂交细胞株产生的抗体（针对免疫原的)，都是球蛋白分子的混合物，上面带有一个片段，就是所需要的链的结合物。4.7融合剂的比较
在细胞杂交时用同一种骨髓瘤细胞和同一种小鼠脾细胞，但PEG作用后的杂交细胞存活数比经仙台病毒作用的存活数要少，所以我们选用不同厂牌和分子量的PEG作细胞融合试验，表上所列数据，为培养23天后，计数24孔培养孔中的阳性孔，结果如表7所示。
表7 PEG聚乙二醇比较表
产品来源
细胞融合方法
总阳性孔
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
BDH200
0
0 Merck200
0
Serva200
0
0
0
0 Baker1000
0 BDH1000
0
Koch-Light1000 5
3数 Merch1000 GK 12
3Serva1000
1Merck20000
由表7说明，所有低分子的PEG结果都差，其中有些是明显有毒性反应。但分子量太大阳性数也会有所下降，因为它们过份地粘稠，甚至加热至45℃时，也会粘在管壁上，但当高压时加入等量的盐水则较为稳定。4.8细胞融合温度的比较
脾细胞和骨髓瘤细胞在应用前都泡在水浴中，洗细胞时也都用低温离心机(2℃)。偶尔有一次制备细胞时没有进行冷处理，而洗脾细胞时离心沉淀也在室温进行，得到较多的杂交细胞株，这样重复试验，室温比常规的4℃和0℃往往结果好，见表8。
表8 温度对细胞融合的影响
实验
0-4℃
20℃
5×106
5×10 6
1/24
8/24
4/24
21/24 2
5/24
27/48
15/48
46/48 3
3/24
15/24
5/24
22/24 4
4/24
14/24
6/24
24/24 总阳性孔数
113
脾细胞数如表8所列，分别与5×106FO细胞融合，融合温度有0℃一4℃和20℃，在培养2l天时，活细胞数多于104为阳性。4.9各种营养液的比较
各种营养液与血清的比较分成几个实验进行，列于表9。
表9 各种营养液的比较
参加细胞
DMEM＋10%血清
RPMI＋10%血清
Iscove`s＋10%血清骨髓瘤细胞 脾细胞 马
牛
胎牛
马
牛
胎牛
马
牛
胎
牛
X63（5×10 6）10 6
0
5×10 6
5×10 6
5×10 6 20
15 17
20
脾细胞(三只小鼠脾细胞混合物)和骨髓瘤细胞的用量如表9所列，接种于24孔培养板，每孔并含有3×104的巨噬细胞，第23天确定阳性培养孔数，本实验包括三个内容：脾细胞的用量，RPMI培养液和I scove` s培养瓶三种血清的比较。由表9可知：DMEM、RPMI、Iscove` s三种营养液都可得到较多的杂交细胞株，而对Iscove` s营养液比其他培养液要更好些。x 63的融合物在培养液中若用10％马血清虽然可以，但并不是常常都很理想。为了避免以后需要克隆限制杂交细胞的数量，我们常规应用Iscove` s培养液，也选用RPMI1840，因为它的缓冲能力较强，不完全依赖于合适的气体环境。Sp2/0(2×107)10 6
0
0
0
0
0
FO(5×10 6)10 6
4.10细胞换液的方案
表10 不同细胞换液方案比较
实验
换液方案
下列各天出现的阳性孔数
总阳性
6 8 10 12 14 16 20 24 28 Ⅰ
0
0
Ⅱ
0
07
Ⅲ
1数
Ⅰ
0
0
04
Ⅱ
0
410
1Ⅲ10 14 15
1516 17
表10试验了在细胞融合后，直接加入HAT选择培养波，让其直接暴露于高浓度的氨基喋呤中，比较结果，把细胞融合物直接接种于HAT培养液中为优。
4.11微量培养
表11 在微量培养板上作杂交瘤细胞株选择培养
细胞融合物
培养板 FO细胞
脾细胞
标准板
微量5×10 6
2×10
板
6×10 6
15×10 6
10 7
2×10 6
6×10 6
15×10
2×10 7
2×10 6
6×10
15×10
表11可知，微量孔培养的杂交细胞数常多于常规培养孔，最高可达106，细胞融合混合物为6×106。脾细胞和107FO骨髓瘤细胞，接种整个微量培养板可希望获得12—16个杂交瘤细胞抹。
高度免疫的BALB／c小鼠脾细胞和FO骨髓瘤细胞融合，用50％PEG 4000作为促进剂，细胞数皆列于下表，分别接种于24孔培养板(每孔含有2×104巨噬细胞于2mIHAT)和微量培养板(即96孔板，每孔含有3×103巨噬细胞于0.25HAT培养液中。)于第21天计算阳性数[3]。
4.12无血清培养液
检测杂交瘤细胞株的产物常规是应用其细胞培养瓶其中含有血清，也有胎牛血清。对检测工作来说并不希望有这些东西，因为往往会干扰测定，或者对某些测定带来较高的基础值，也会造成单克隆产品分离和纯化的困难、我们试用了标记氨基酸或无血清培养液以取得在这种条件下的单克隆抗体。
用MEM作基础，加入标记物可获得理想的结果，可以从商业购得缺乏亮氨酸的MEM，原液的配制：无亮氨酸的MEM 45ml，加入[14C]亮氨酸5m1[14C]leucinc(250uCi)、lml10％葡萄糖和0.5m120％牛血清蛋白，4℃备用，在使用前临时配制应用液，即10ml原油十0.2m1100×谷酰胺十0.10m1100×丙酮酸钠十0.2m1100×V itra—mines十 0.1m1100×抗菌素和0.01ml 0.1M硫乙二醇，接种106活细胞于此培养液中，37℃，过夜，此时最好应用玻璃管并加塞[4]。
在实验中，所有的杂交瘤细胞克隆只在Iscovs`s完全培养液中才能生长旺盛(GuiL—bert and lscove，1976Iscove和M elches，1978)，其中含有转移素transferrin和血清蛋白为唯一的蛋白成份，虽然配制这种培养液比较麻烦，但能支持杂交细胞抹继续生长和分泌抗体、每天能产生纯抗体10-20mg。
5.结论
通过小鼠免疫培养，腹腔内巨噬细胞的采取，微量培养，大孔培养，可得到一定量的杂交瘤细胞，同时分析了实验的一些影响因素，结果如下。
（1）.各次细胞融合结果的差别，只有在巨噬细胞活跃的培养孔中，才能得到抗体阳性的杂交瘤细胞克隆。
（2）.巨噬细胞对杂交细胞的作用，不加巨噬细胞，没有杂交单克隆细胞，加入巨噬细胞，结果大大增加。
（3）.加入巨噬细胞的用量和时间，投入实验的脾细胞的量减少10倍，培养28天后，活细胞多于104的阳性孔。（4）.用不同动物巨噬细胞作为喂养细胞，巨噬细胞来源于何种品系的动物并不重要，来自不同种动物的腹腔洗液，或者杂交动物的小鼠、甚至大鼠或豚鼠的巨噬细胞都可促使杂交瘤细胞生长
（5）.限量脾细胞杂交试验可知脾细胞加入量为4×106时，结果较好，细胞融合数较多。
（6）.骨髓瘤细胞株的比较中，选择合适的骨髓瘤细胞株（x63），产生单克隆抗体的几率较高，但不是都产生同一种抗体的。
（7）.融合剂 PEG聚乙二醇的比较中，所有低分子的PEG结果都差，其中有些是明显有毒性反应，但分子量太大阳性数也会有所下降。
（8）.细胞融合温度的比较中，室温比常规的4℃和0℃往往结果较理想。
（9）.各种营养液的比较，DMEM、RPMI、Iscove` s三种营养液都可得到较多的杂交细胞株，而对Iscove` s营养液比其他培养液要更好些。
（10）.不同细胞换液方案比较中，细胞融合物直接接种于HAT培养液中为优。
（11）.在微量培养板上作杂交瘤细胞株选择培养，可知微量孔培养的杂交细胞数常多于常规培养孔。
（12）.在无血清培养液中，所有的杂交瘤细胞克隆只在Iscovs`s完全培养液中才能生长旺盛。
6.参考文献
[1]齐香君，现代生物制药工艺学[M]，化学工业出版社，2003.9 [2]甄永苏等，抗体工程药物[M]，化学工业出版社，2002.5 [3]李元等，现代工程药物[M]，化学工业出版社，2002.5 [4]张和君，单克隆抗体细胞免疫反应技术[M]，云南科技出版社，1985.2 7.致谢
本课题在选题及研究过程中得到杜老师的悉心指导。在杜老师的精心指导下，为我们开拓研究思路，顺利完成论文。杜老师一丝不苟的作风，严谨求实的态度，踏踏实实的精神，不仅授我以文，而且教我做人，给以我们终生受益无穷之道。对杜老师的感激之情是无法用言语表达的。
第五篇：单克隆抗体药物
浅谈单克隆抗体药物
摘要：单克隆抗体药物是生物医药领域中最耀眼的明珠。该类药物具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，代表了药品治疗领域的最新发展方向，在肿瘤、自身免疫性疾病的治疗手段不断升级过程中，单抗药物扮演着不可替代的角色，已经成为全球靶向治疗药物的主流。在刚刚兴起的细胞免疫治疗中，单抗药物同样是位列第一的品类，单抗产业是目前乃至未来医药行业中极具投资价值的细分行业。本文从单克隆抗体简介，常见的单克隆抗体药物、国内外单克隆抗体药物的研发现状，及对单抗药物的展望几个方面做一简介。关键词：单克隆抗体单抗药物研发现状 1单克隆抗体
抗体是由B淋巴细胞转化而来的浆细胞分泌的，每个B淋巴细胞株只能产生一种它专有的、针对一种特异性抗原决定簇的抗体。这种从一株单一细胞系产生的抗体就叫单克隆抗体，简称单抗。这些抗体具有相同的结构和特性。抗体与特异性表达的肿瘤细胞表面蛋白质结合，从而阻碍蛋白质的表达，起到抗肿瘤作用。抗体还可使B淋巴细胞产生免疫反应，诱导癌细胞凋亡。早期单抗为鼠源性单抗,易被人体免疫系统识别，应用受到限制。后来采用基因工程的方法生产人源或人鼠嵌合型单抗，广泛应用于临床。2常见的单克隆抗体药物
2.1利妥昔单抗（Rituximab）-美罗华-CD20单抗
第一个被美国食品药物管理局（FDA）批准用于临床治疗的单抗，是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，能特异性地与CD20结合，导致B淋巴细胞溶解的免疫反应，抑制其增殖，诱导成熟B淋巴细胞凋亡和提高肿瘤细胞对化疗的敏感性。90%以上的B淋巴细胞淋巴瘤细胞均有CD20表达，不表达于非定向干细胞或浆细胞。本药可使耐药淋巴瘤细胞对VP-
16、顺铂重新敏感，用于CD20表达的复发或化疗耐药的惰性B淋巴细胞淋巴瘤，有效率46%。利妥昔单抗+CHOP方案为治疗弥漫大B淋巴细胞淋巴瘤标准方案，可使全完缓冲（CR）率、生存时间明显延长[2-3]。
2.2曲妥珠单抗-赫赛汀-HER-2单抗
为重组DNA人源化的抗p185蛋白（癌基因）单克隆抗体-IgG抗体。进入人体后能选择性地与由细胞核内表皮生长因子2基因调控的p185糖蛋白结合。本身具有抗肿瘤作用，还可提高肿瘤细胞对化疗的敏感性从而提高化疗的疗效。主要用于HER-2高表达的晚期乳腺癌,单一有效率15%~20%,可联合TXT一线治疗MBC，有效率61%[4]。2009年ASCO年会上公布ToGA研究结果，3807例晚期胃癌患者中，Her-2阳性表达率为22.1%，曲妥珠单抗联合化疗比单纯化疗提高MST近3个月，PFS延长1.2个月，有效率提高约13%，而且无明显细胞毒性差异。
2.3西妥昔单抗-爱必妥（ERBITUX、C225）-EGFR单抗
重组人鼠嵌合单克隆抗体，可与人的正常细胞及肿瘤细胞的表皮生长因子受体（EGFR）的胞外激酶特异性结合，竞争性抑制EGFR和其他配体结合，可抑制EGFR过度表达的肿瘤细胞生长，可逆转化疗药物耐药。C225联合伊立替康用于EGFR表达阳性、伊立替康治疗失败或耐药的复发或转移性结直肠癌，或单药治疗不能耐受化疗者，生存质量明显提高。与伊立替康和氟尿嘧啶有协同作用，可以使耐药患者敏感。C225联合FOLFOX4一线治疗EGFR阳性的转移性大肠癌II期总有效率为FOLFOX的两倍，约21%患者治疗后转移灶得以切除。C225联合卡培他滨与奥沙利铂治疗晚期结直肠癌疗效显著。C225还可单药二线治疗铂类化疗失败的复发或转移性头颈部鳞癌。
2.4贝伐单抗(bevacizuma)-阿瓦斯汀AVASTIN-VEGF单抗 针对VEGF-A亚型的重组的人源化IgG1单克隆抗体，与血管内皮生长因子VEGF结合,阻断VEGF与内皮细胞上的受体结合。主要用于治疗大肠癌、NSCLC、乳腺癌。联合FOLFOX或IFL一线治疗初治转移性大肠癌或复治的晚期大肠癌。联合紫杉醇治疗转移性乳腺癌可以显著提高有效率（RR），延长PFS。2007年欧盟批准贝与紫杉醇联合治疗转移性乳腺癌，另对胰腺癌有治疗作用。
3国内单克隆抗体类生物治疗药物研发现状
我国抗体药物的研发从上世纪80年代开始起步，基础相对薄弱。与发达国家相比，我国抗体药物的研发和产业化主要表现为核心技术、人才队伍、产学研、工艺水平和投资规模等方面的差距。但近年来在包括国家“重大新药创制计划”、“国家863”等科技计划的持续支持下，我国抗体药物领域取得了长足的发展，出现了一些具有较高创新水平的单克隆药物品种课题。2012年国务院发布的“十二五”国家战略性新兴产业发展规划提出:加快构建具有国际先进水平的现代生物产业体系，产业规模年增速20%以上。国家计划“十二五”期间向生物医药产业的重大新药研发和创制领域专项资金在400亿元左右，比十一五期间翻了一番多，这将对创新抗体药物等生物技术药物的产业化进程起重要推动作用。目前我国在抗体药物的原始创新工作中，拥有了包括噬菌体抗体文库、人免疫球蛋白转基因小鼠等全人源化抗体技术突破，为全新的具有自主知识产权的治疗性单抗类产品研发提供了技术保证。在抗体药物产业化方面，我国已经建立了涵盖中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等多种工程细胞的大规模培养工艺，突破了高表达载体的构建与优化，高通量细胞培养筛选系统，无血清培养基等关键技术。在大规模细胞培养条件下，抗体表达水平有了突破性进展，表达水平从每升0.5g以下上升到了2～3g，甚至更高。在反应器规模上，从单反应器体积500L以下上升到了1000～3000L，最高达到5000L，突破了生产规模的瓶颈，目前已初步实现了抗体药物从基础研究到产业化生产的跨越。
我国当前正处在抗体药物快速发展的起步阶段，截至2013年底，共批准21个抗体类药物上市，其中进口抗体类药物12种，国内自主研发抗体药物9种。近年来，中国单克隆抗体领域的发展受到世界越来越多的关注和重视，抗体药物在中国市场保持了50%的平均增长率，单抗药物研发已经被列入国家重点公关项目。据不完全统计，国内涉足抗体类生物治疗药物领域的研发机构、科研院所和生产单位超过近百家，其中不乏原来专注于小分子化学药物研发的生产企业。目前批准用于临床的抗体药物有超过20个产品，这些产品主要集中在血管内皮生长因子(VEGF)、CD20(clusterofdiflerentiation，CD)、表皮生长因子受体(EGFＲ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和人表皮生长因子受体2(HEＲ2)这5个靶点，例如针对TNFα靶点的生产厂家已超过了15家。预计到2015年，我国抗体药物市场规模将达到325～650亿元。
4国外抗体类生物治疗药物研发现状
在国际制药领域，一方面，老牌的大型制药公司通过兼并其他研发团队的产品，建立其抗体药物的产品链;另一方面，大型制药企业通过组建自身抗体药物研发平台，以保持其在抗体类药物开发上的技术优势。从研发产出水平来看，2013年国外抗体药物处于平稳增长的一年，截至2013年12月，一年内有三个新型的抗体药物上市，它们分别是:罗氏的Kadcyla用于治疗晚期(转移)HEＲ2-阳性乳腺癌［2］;罗氏的Gazyva用于治疗慢性淋巴细胞白血病［3］;印度百康的Alzumab是全球首个抗CD6单克隆抗体，用于治疗慢性斑块型银屑病［4］。罗氏的Kadcyla是继Adcetris之后第二个被FDA批准上市的新一代抗体偶联药物(antibodydrugconjugate，ADC)，基因泰克公司已在试验将这款药物作为一线治疗药物用于转移性疾病及与帕妥珠单抗合并用药，以扩展该药的适用范围，从而应对未来重磅炸弹级产品曲妥珠单抗专利的到期及生物类似药的激烈竞争。此外，基因泰克通过一项头对头的临床试验获得了Gazyva的批准，这是美国首个以“突破性新药”资格获得FDA批准的药物及首个获批的糖工程化单克隆抗体。除了传统的IgG型抗体类药物，近年来抗体药物研发的新进展还包括ADC和双功能抗体(bispecificantibody)等。利用抗体实现细胞毒性药物靶向递送的理念可追溯至上世纪初。随着基因工程技术、抗体制备技术的成熟，以及新型化学连接技术的出现，近年来这一领域取得了里程碑式的发展，并实现了药物的临床转化。早在2000年，gemtuzumabozogamicin(商品名Mylotarg)就已成为首个获得FDA批准的抗体偶联药物，用于治疗急性髓系白血病(AML)，然而Ⅲ期临床试验发现其具有肝毒性，并且与对照组相比疗效并不显著，辉瑞公司于2010年6月申请退市。2011年8月，ADC药物brentuximabvedotin(商品名Adcetris)通过FDA批准，同时它也是近30年来首个FDA新批准的用于治疗霍奇金淋巴瘤的药物和首个用于治疗罕见疾病系统性间变性大细胞淋巴瘤的药物。2013年2月获准上市的Kadcyla是批准用于治疗实体肿瘤的第一个抗体偶联药物，也是个体化治疗的一大突破。根据2012年11月发表在新英格兰医学杂志上的EMILIA临床实验结果，Kadcyla治疗组的客观应答率显著高于卡培他滨/拉帕替尼对照组。此外，Kadcyla组的所有二级实验终点都优于对照组，而且3～4级不良事件的发生率也大为降低。相信在不久的将来，Kadcyla将成为HEＲ2阳性乳腺癌的一线标准疗法。因其靶点特异、功能更强、选择性好等特点，ADC研究在未来几年里将继续成为抗癌领域的研究热点。ADC的作用机制明确，但其研发技术难度高，包括靶点选择、药物、接头的选择、偶联位点及偶联工艺的确定，如何在抗体如此高度复杂、异质性的生物大分子上继续进行化学修饰，并确保药物总体的偶联效率(drugantibodyratio，DAＲ)对研发和工艺开发都是全新的挑战，这也是诺华、罗氏、雅培等国际制药巨头选择购买成熟技术或专利的根本原因。此外，美国Ambrx公司通过定点嵌入非天然氨基酸，实现在单克隆抗体上定点、定量接入抗肿瘤的小分子药物，以获得单一的ADC纯品，这相当于在“生物导弹”上精确地装上了“核弹头”，使得治疗更加安全、有效、定向，这一创新技术也将为新一代ADC药物的开发提供新思路。
对于双功能抗体，其具有同时抑制两个细胞表面受体，阻断两个配体，交联两个受体或者招募T细胞到肿瘤细胞等作用，所以其治疗效果理论上更加有效、费效比理想。目前国外有16个双功能抗体已进入临床阶段，因此国外工业界在这一领域发展迅速，我国尚处于前期研究的起步阶段。5展望
在过去的一年中，国际抗体药物研发取得了较大的进展。科研实力雄厚的国际知名制药公司都把抗体药物开发转向以下几个方向:针对新抗原的抑制或激动剂;原有产品人源化、糖基化改造、抗体新适应证、抗体偶联药物、双功能抗体、抗体复合物、抗体生物类似药研究等，并且上述领域也将是未来一段时间内抗体研发的焦点。
回顾过去，随着生物技术的不断进步，抗体药物的生产过程中，表达系统不断完善，培养条件不断改进，以致表达水平不断提高，随之生产成本不断降低。同时，随着人类后基因组学和代谢组学的到来，越来越多的新靶点被发现和研究，扩大了抗体所针对的抗原范围，也必将扩大抗体药物的市场。相信未来抗体产品的生产将逐渐走向高纯度，高产量，低成本的方向发展，也给目前临床上某些难以治愈性疾病带来曙光。而我国抗体药物市场巨大，虽然2013年11月底，我国批准了成都康弘药业“康柏西普”的上市，但目前我国对抗体药物的研制仍主要集中在抗体生物类似药的研发。我国抗体药物的研究资源相当丰富，在对疾病更深一步的探讨和研究中很容易发现新的靶标，以此为基础可研究开发针对这些靶标的新型抗体,从而建立我国在抗体药物领域的知识产权体系。基因工程等技术的进一步深化，可以进一步的对抗体进行改造，制备出具有更多生物活性的抗体，提高机体的免疫能力。在ADC领域，抗体的作用多为发挥药物投送载体的功能。我国是化学原料药大国，相信在接头、毒素领域的创新研发一定会推动我国创新抗体偶联药物的成果转化，从而治疗或缓解某些疾病。针对我国的抗体药物研发现状，国家已经制定了相应的政策，鼓励和带动抗体药物的研发。“重大新药创制计划”等国家级科技项目在抗体领域也在持续投入，并通过建立、完善配套的技术平台和产业化基地，通过加强高等院校、生物技术公司、大型医药研究和生产企业等的交流和合作，引进并吸收国外先进的理论和技术，可望突破抗体大规模产业化制备的瓶颈，推动产业化的进程。6结语
综上所述，全球单克隆抗体药物专利的到期，为生物仿制药开发带来了机遇。各国陆续出台相关指导原则，各大药企也纷纷对其开展研发。全球发达国家对降低医疗费用的呼声和原研生物药物纷纷专利到期，为生物仿制药的发展提供了巨大的动力。单克隆抗体药物在生物药物中占主导。相对于一般生物仿制药，单克隆抗体仿制药具有其独特的相对分子质量大、结构复杂、作用机制复杂、免疫原性、生产过程决定其质量、作用专一高效等特殊性，使其在开发中相比于其他类别仿制药具有更大的挑战性，但同时使得单克隆抗体仿制药在开发成功后具有别的仿制药无可比拟的优势。
我国仿制药发展较晚，相比国外经验较少，经过不懈地努力发展，与国际领域水平的差距不断缩小。我国正在积极制定符合本国生物仿制药的指导原则，以促进生物仿制药的发展。相比于我国仿制药制度的空白，生物仿制药指导原则的探索也能促进我国仿制药的发展。相信我们能够克服政策、技术、资金和市场的挑战，抓住这次机遇，使我国的生物仿制药行业发展壮大。参考文献：
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