第一篇：基因工程的诞生和发展
第一章
基因工程概述
第一节
基因工程的诞生和发展
一、基因
1．Mendel的遗传因子阶段
Mendel G.J.(1822-1884).1856-1864豌豆杂交实验。1866年发表论文，提出分离规律和独立分配规律 1900年Mendel遗传规律被重新发现遗传学的元年
Mendel提出：生物的某种性状是由遗传因子负责传递的。是颗粒性的，体细胞内成双存在，生殖细胞内成单存在。遗传因子是决定性状的抽象符号。
2．Morgan的基因阶段
1909年丹麦遗传学家Yohannsen(1859-1927)发表了“纯系学说”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel “遗传因子” 的 概念。但没有提出基因的物质概念。
1910年以后，Morgan T.H.等提出了基因的连锁遗传规律。说明了基因是在染色体上占有一定空间的实体。基因不再是抽象符号，被赋予物质内涵。
3．顺反子阶段
1957年，本泽尔（Seymour Benzer）以T4噬菌体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细结构，提出了顺反子（cistron）概念：顺反子是1个遗传功能单位，1个顺反子决定1条多肽链。
4.现代基因阶段
（1）操纵子
启动基因＋操纵基因＋结构基因（2）跳跃基因
指DNA能在有机体的染色体组内从1个地方跳到另一个地方，它们能从1个位点切除，然后插入同一或不同染色体上的另一个位置。（3）断裂基因
1个基因被间隔区分成不连续的若干区段，这种编码序列不连续的间断基因被称为断裂基因。
（4）假基因
不能合成出功能蛋白质的失活基因。（5）重叠基因
不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的 即重叠的。
现代对基因的定义是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。
二、基因工程的诞生
一般认为1973年是基因工程诞生的元年
（S.Cohen等获得了卡那霉素和四环素双抗性的转化子菌落)理论上的三大发现和技术上的三大发明 对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。
（一）DNA是遗传物质被证实 1944年，Avery O.T.利用肺炎双球菌转化实验
1944年，美国洛克菲勒研究所的Oswald Avery等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。
（1）S型菌细胞提取物及其纯化的DNA都可使R型菌转变成S型菌；
（2）经DNase 处理的S型菌细胞提取物失去了转化作用。
（3）经胰蛋白酶处理的S型菌细胞提取物仍有转化作用。
不仅证实了DNA是遗传物质，而且证明了DNA可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是现代生物科学的革命性开端。
（二）DNA双螺旋模型的提出
DNA是遗传物质已被证实，但是DNA是怎样携带并传递遗传信息的？在细胞增殖过程中，DNA是怎样复制的？因此，对于DNA结构的研究成为了当时生物学家研究的热点。
1953年，Francis Crick和James Watson搜集了力所能及的资料，提出了DNA的双螺旋模型。随后，DNA的半保留复制和半不连续复制机理也被阐明，为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。
（三）“中心法则”和“操纵子学说”的提出
既然，DNA是遗传信息的载体，那么它是如何传递遗传信息的呢？遗传信息又是如何控制生物的表型性状的呢？
以Nireberg等为代表的一批科学家经过艰苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到1966年，全部破译了64个密码子，并提出了遗传信息传递的“中心法则”。
1961年，Jacques Monod和 Fancois Jacob提出了原核基因调控的 操纵子模型（operon model）。
（四）工具酶的发现和应用
1970年Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II，1972年，H.W.Boyer等相继发现了ＥcoR I 一类重要的限制性内切酶。
1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年H.G.Khorana等发现的T4 DNA连接酶具有更高的连接活性。
1970年，Baltimore等和Temin等在RNA肿瘤病毒中各自发现了反转录酶，完善了中心法则，用于构建cDNA 文库。
（五）载体的发现及其应用
载体主要是小分子量的复制子如：病毒、噬菌体、质粒。
1972年，美国Stanford大学的P.Berg 等首次成功地实现了DNA的体外重组；
6、重组子导入受体细胞技术
1944年，肺炎链球菌被成功转化。
1970年，大肠杆菌才被成功转化，得益于CaCl2的应用
基因工程诞生
1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。1973年被定为基因工程诞生的元年。
第二节 基因工程的研究内容
一、基因工程的概念
在分子水平上，提取或合成不同生物的遗传物质，在体外进行切割、再和某一载体进行拼接重组，然后再将重组的DNA导入宿主细胞内，最后实现目的基因稳定复制和表达的过程。
二、基因工程研究的基本步骤
1、从生物体中分离得到目的基因（或DNA片段）
2、在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中得到
重组DNA分子。
3、将重组DNA分子导入受体细胞中，并进行繁殖。
4、选择得到含有重组DNA分子的细胞克隆，并进行大量
繁殖，从而使得目的基因得到扩增。
5、进一步对获得的目的基因进行研究和利用。比如，序列分析、表达载体构建、原核表达以及转基因研究
和利用等。
第三节
基因工程的成就和前景展望
一、成就
1.医药领域
1977年，激素抑制素的发酵生产成功。Itakara等，化学合成的激素抑制素基因和大肠杆菌-半乳糖（苷）激酶基因插入到PBR322中得到重组质粒，并通过大肠杆菌生产出含有激素抑制素的嵌合型蛋白，经溴化氰处理后释放出了有生物活性的激素抑制素。首次实现了真核基因的原核表达。用价值几美元的9升培养液生产出50毫克的生物活性物质，这相当于50万头羊脑的提取量。
1978年，Goeddel等，人胰岛素的发酵生产成功。
1979年，Goeddel等，又在大肠杆菌中成功表达了人生长激素基因。1980年，Nagata等，遗传工程菌生产干扰素获得成功。
1981年，用遗传工程菌生产的生物制剂包括动物口蹄疫疫苗、乙型肝炎病毒表面抗原及核心抗原、牛生长激素等。
1982年，重组DNA技术生产的药物-人胰岛素进入商品化生产。1983年，基因工程生产狂犬病疫苗取得突破型进展。
2.植物基因工程的发展迅速
植物转基因育种的发展优势（1）扩大了作物育种的基因库
转基因育种打破了常规育种的物种界限，来源于动植物和微生物的有用基因都
可以导入作物，培育成具有某些特殊性状的新型作物品种。（2）提高了作物育种的效率
作物转基因育种不仅大大缩短育种年限，而且可成功地改良某些单一性状却不
影响改良品种的原有优良特性。（3）减轻了农业生产对环境的污染
转基因抗虫棉花的大面积种植和推广，不仅可以减少化学杀虫剂对棉农及天敌的伤害，而且可以大幅度降低用于购买农药和虫害防治的费用。另外，随着高
效固氮转基因作物及高效吸收土壤中磷元素等营养元素的转基因作物不断问世
和推广，农用化肥的利用率将极大地提高，这对减少农田污染具有重要意义。（4）拓宽了作物生产的范畴
各种有价值的蛋白产品都可以利用植物反应器进行高效生产，番茄、马铃薯、莴苣和香蕉等作物已被成功用于生产口服疫苗。另外，各种工业原料，比如纤 维素、海藻糖和可降解塑料等也可以用植物来生产。有人甚至预言，除了钢筋
混凝土之外，未来的转基因作物将可能生产出人类所需要的一切产品。植物基因组计划
水稻、玉米、棉花、大豆、高粱和番茄 植物分子育种
高产、优质、高效和多抗性 植物作为反应器
香蕉、马铃薯、番茄等 酒精、石油、工业酶等
3.工业领域
环保工业
能降解工业废品、农药残留等基因工程菌的构建
酶制剂工业
耐热、耐压、耐盐、耐溶剂的酶基因转化构建的工程菌
食品工业
改善食品品质的转基因作物
化学与能源工业
生产乙醇、甘油、丙酮等的转基因生物
二、我国基因工程部分研究进展
1.转基因抗病虫植物
我国科学家将抗虫基因导入棉花，获得了抗虫植株，对棉蛉虫的抗虫效果十分显著。抗黄矮病、赤霉病、白粉病转基因小麦和抗青枯病马铃薯也已研究成功，开始田间加代繁殖。
2.基因工程疫苗
乙型肝炎是危害我国人民健康的严重疾病，我国乙肝病毒携带者1亿 1千万人，其中40％左右的慢性肝炎可能发展成为肝硬化和原发肝癌。以往乙肝疫苗是从人血清中提取，基因工程乙肝疫苗的研制成功，不仅有巨大的经济效益，而且有巨大的社会效益。基因工程乙肝疫苗是我国正式批准投放市场的第一种高技术疫苗，在20多项指标上达到国际先进水平，获国家科技进步一等奖。继乙肝疫苗之后，我国又研制成功了痢疾、霍乱等数种基因工程疫苗，并经国家批准进入临床试验。
3.基因工程药物
干扰素是一种广谱的抗病毒和抗肿瘤高技术药物，对防治病毒性肝炎和恶性肿瘤有重要的作用。现已有了3个品种的基因工程干扰素获得国家新药证书，开始大批量生产。除此之外，我 国还研制成功了肝癌导向药物（生物炸弹）、系列恶性肿瘤辅助治疗药物等十余种基因工程药物，有些已获试生产文号或进入中试开发阶段。
4.动物克隆和转基因研究
在“神舟”五号成功着陆的同一天，包括两头转基因体细胞克隆牛在内的10头体细胞克隆牛现身山东梁山县。我国转基因体细胞克隆技术及体细胞克隆技术的研究与应用达到国际前沿水平。
体细胞克隆牛“乐娃”，由于成功地转入了绿色荧光蛋白基因，成为我国首例转基因体细胞克隆牛，标志着我国在转基因体细胞克隆技术方面的新突破。
第二篇：基因工程的发展历程
基因技术的发展历程
2011级初等教育理科 代林宏
[摘要]
基因技术作为２１世纪生物科技的核心技术之一，通过操纵、改变DNA上基因的容易来改变生物属性和特点，包括胰岛素生物工程、干细胞技术、克隆技术等。基因科技术的每一次突破和发展对人类的生产生活都有着重要的影响。[关键词] 基因技术；成就；发展历程；
基因技术是指通过操纵、改变（增加或减少)DNA上基因的容易来改变生物属性和特点，以达到有利于人类目的的生物科学技术。如把胰岛素基因置入大肠杆菌产生人类稀缺的胰岛素生物工程；干细胞技术，克隆技术等。这一系列的技术由基因到伟大的人类基因组计划以及后来的一系列生物高科技的发展有一个漫长的历程。
19世纪60-80年代间确定了细胞中的两种核算，脱氧核糖核算及核糖核酸；染色质，染色体等物质，对细胞结构有了基本的认识。
1909年，丹麦的约翰逊把遗传因子命名为“基因”。随后美国人摩尔根和他的学生发表了《遗传的物质基础》和《基因论》。证明了基因是染色体上的遗传单位。
1944年美国的艾弗里证明了遗传基因就在DNA上。剑桥大学的卡文迪许实验室里，沃森和克里克研究发现了DNA分子双螺旋结构，并在科学期刊《自然》上面发表了论文，这位之后的基因技术发展奠定了基础。
1956年，美国的肯恩伯格从大肠杆菌里分离出了一种催化核苷酸形成DNA的酶－DNA聚合酶，作为DNA体外复制技术的起始。随后提出了中心法则、操纵子学说，并成功的破译了遗传密码，使生物学的发展进入了另一个阶段。
所有用于治疗糖尿病的胰岛素都来自一种细菌，其DNA中被插入了人类可产生胰岛素的基因，细菌便可自行复制胰岛素。基因工程技术使得许多植物具有了抗病虫害和抗除草剂的能力；在美国，大约有一半的豆和四分之一的玉米都是转基因的。
运用胚胎遗传病筛查技术可使患儿的父母生一个和患儿骨髓匹配的孩子，然后再通过骨髓移植来治愈患儿。
基因工程在20世纪取得了很大的进展，这至少有两个有力的证明。一是转基因动植物，二是克隆技术。转基因动植物由于植入了新的基因，使得动植物具有了原先没有的全新性状，如抗虫西红柿，生长迅速的鲫鱼，转基因烟草等。1997
[1]
年世界十大科技突破之首就是克隆羊的诞生。通过无性繁殖产生了第一只哺乳动物绵羊“多利”，它完全秉承了给与它细胞核的那只母羊的遗传基因。“克隆”一时间成为人们注目的焦点。
1990年10月，阿波罗登月计划-人类基因组计划正式启动。1999年12月1日，国际人类基因组计划联合小组宣布，完整破译出人体第22对染色体的遗传密码，这是人类成功的完成人类染色体完整基因序列的测定。2000年6月26日科学家公布人类基因组工作草图，标志着人类在解读自身“生命之书”的路上迈出了重要的一步。
综上所述，基因技术的不断发展创新突破给人类的生产生活带来了很大的便利，特别是人类基因组计划的实现使人类重新认识了自己，使科学技术得发展变得无可限量。
参考文献 : [1] 黄国琼； 秦宇彤； 罗长坤．生命科学的发展对医学的影响[J]．人文社会医学版，2011-02-08，32（2）
[2] 殷实． 培养创新素质,迎接未来挑战[J]．自然科学版，2009-11-10，23（1）
[2]
第三篇：加油站诞生发展记
从上游到下游百年变迁 ——加油站诞生兴起发展记
综合整理/本刊记者 冯为为
20世纪初世界上第一座加油站在美国诞生，“加油站”这个新名词也因此被历史记载。经过百年的变迁与发展，加油站不仅代表了城市的形象，更促进了各国GDP的增长，成为生活中不可缺少的一员。
一百多年前，全球的石油公司都在上游找油、采油与中游炼油中忙活，随着汽车工业的迅猛发展和普及，促使了加油站如雨后春笋般涌现，逐渐成为大众生活中的一部分。
20世纪初，经历了很多周折摸索，世界上第一座加油站在美国诞生，它的出现轰动了全球。当时美国《全国石油消息》报也做了相应的报道，在内页登了一则题目是《为开车人设立的车站》的小消息，使加油站走上了历史舞台，从而揭开了它的发展序幕。
诞生：杂货店后的大桶
19世纪末20世纪初，欧美各国的汽车运输行业迅速崛起，当最早的汽车开始在城市和乡村道路上穿行的时候，加油是件不大容易的事，因此为汽车服务的加油站便应运而生。
到这里大家也许会问，一百多年前的加油站和现在的加油站有何区别呢？原始的加油站只是一个成品油零售商，通常附属于杂货店，一般在屋后储存大桶的汽油，遇有汽车来加油的时候，就用5加仑的桶自大桶灌取，然后倒入汽车油箱。这时，加油是一件复杂的事情。原始的加油过程需要至少3个人来操作。同时，五金店、杂货店也在经营汽油，1加仑的玻璃瓶包装是当时的标准售油方式。
1905年，手动加油机发明后，自此便开始了加油站的发展史。虽距离美国人亨利·福特他那著名的发明，被视为汽车工业史上具有里程碑意义的T型汽车——同时也是人类历史真正意义上的燃油汽车还有三年的时间，但美国密苏里州圣路易斯的商人哈利·格伦纳与克雷姆·雷辛格已经嗅到了某些潜藏的商机。他们一起研究了在车流较大的公路附近建立一座汽车加油站的具体方案，投资兴办了世界上最初的“圣路易斯汽车加油站”，采用重力注油罐连通一根橡胶软管给汽车加油，极大地方便了路过此地的驾驶员，同时也为他们带来了极为可观的收入。
两年后，当一座具有现代建筑物的房檐前伸，由加州标准石油公司（即雪佛龙公司的前身）建设而成，有宽大停车场的“加利福尼亚汽车加油站”在美国的西雅图挂牌营业。此时，油站里仅有一台手动加油机和一条管线连接的油罐。又过了3年，这里出现了以地下油罐、油泵、管线和加油机构成的加油站。这个时期，各种各样的加油方式才如雨后春笋般涌现出来。
随后，汽车加油站作为新兴的产业在美国乃至世界各地迅速崛起，成品油销售被市场规范化，因此带动了相关行业的经济复苏。1912年，路易斯安那标准石油公司在田纳西州开张营业的“孟菲斯汽车加油站”不仅设有13台加油泵，还专门建造一间女用洗手间，雇佣一名女招待员为来此加油的驾驶员免费供应冰水，开创了加油以外的服务项目，促使进出加油的汽车安全有序。
1913年，海湾石油公司在匹兹堡建造了第一座非路肩（OFF—STREET）加油站，包括混凝土地坪、围栏、站房及装备新式的加油机，这种整体结构成为现代加油站的雏形，一直延续到现在。
兴起：统一标准助发展
1920年到1930年，这十年的时间汽车工业发展迅猛，油品需求大增。早期的加油站，只需要和一个炼油厂签订一个供油合同，配备一台加油机，一个地下油罐，再加上一个招牌，加油站就可以开业了。如此简单的投入，加上需求和利益的驱动，使加油站蓬勃发展，石油公司、汽车修理厂、汽车销售点、杂货店、五金店都在门前安装加油机提供加油服务。而石油公司为了更多更快地卖出油品，就放任并推动了这一进程。
从1920年开始，石油公司开始大规模建设自有油站网络，开始了加油站的标准化过程。包括标准化设计的站房和罩棚，标准的品牌标志，标准的颜色，统一的加油设备，统一的客户服务规范等等。这一行动旨在建立品牌和形象，树立油品用户对石油公司的信心。标准化的过程受到了市场的欢迎，取得了良好的效应。
1922年，壳牌石油公司在美国西海岸的加油站达1841座，其中有200座经标准化改造后的油站销量上升到当年所有加油站销量的40%。1928年，油罐汽车的原始型出现在纳席维尔，使油罐汽车与油库结合在一起，从而出现了初级的油品物流体系。这时期最有名的加油站是马刺联销站。
1931年到1940年，是美国加油站的大发展时期，到1933年全美加油站数已经达到17万座。这时的加油站，大多是简陋的路边加油点，通常有一到两台加油机，无罩棚，经营者只想着以最少的投入赚最多的钱。由于政府尚没有相应的管理法规，缺斤少量、质量数量的问题时有发生，大大影响了石油公司的形象，于是加油站成了当时油品行业名声最差的机构组织。
汽车和道路的高速增长，造成石油行业对需求大幅上升的憧憬，新油田的开发使大石油公司提高了炼油能力，全球油品供大于求。同时，受经济萧条的影响，美国国民收入大幅度减少，大约250万辆汽车被搁置，需求下降，油价开始大幅下跌。1931年，油价从17.9美分/加仑下降到10美分/加仑，下降幅度达44%。
盈利的困难使石油公司开始出租自有油站，希望独立油站的运营者能吸收盈利下降的风险。于是市场上首次出现“自有他营模式”的加油站。盈利的困难也使经营者开始考虑到业务多元化的问题，商品和其他服务的销售被引入加油站，TBA（轮胎、电瓶和冷却液、刹车油等其它用品）销售、汽车修理和润滑油换油服务成为油站的标准业务项目。现在，招标租赁与业务多元化已成为各跨国石油公司加油站的“标准”做法。
1931年，加油站经营者发现舒适和便利是吸引汽车驾驶者的最主要的因素，全程服务加油站开始出现。在加油完成的同时，加油站人员已经帮你擦完前窗玻璃，检查好了油位与电瓶，打足了车气，加满了冷却水。
石油公司加油站标准化和品牌建造的持续进行，为加油站营造了更友好的氛围吸引了大量客户，使加油站经营人员开始研究和思考如何提高销售的问题，加油站管理和油品分销也首次成为美国高等学校的授课课程。
30年代是现代化加油站经营管理的形成期，主要有：经销商制度；租赁制度；汽车保养制度由埃索石油公司推出；汽车零件代售TBA出现。
1940年，德克萨斯石油公司推出了加油站的整体设计，在一个罩棚下，加油、商品销售、卫生间、洗车和汽车维修等功能科学地融为一体，各功能区用不同的字母标识，这种既方便又适用，充满了现代风格的加油站很快就受到了人们的欢迎。到了1940年底，德士古公司按照Walter Dorwin的设计新建或改造了 500多座加油站。原先繁琐严谨的加油站建筑模式走到了历史的尽头。加油站不再像古希腊的纪念碑、中国的古塔或乡村民居，而是一个简单方便的加油的地方。
定型：自助服务大推广
1941年开始，受第二次世界大战和太平洋战争的影响，汽油作为重要的战略物资首先要保证军方和盟国的需求。油源的短缺使大部分独立的加油站被迫关闭，美国加油站开始了大规模的整合，自定价格出售油品的时代结束了。大型石油公司开始掌握市场的主导权，长期经销合约成为规范石油公司与加油站经营者之间关系的主流做法。
1946年到1956年，是战后加油站发展的高峰期，系统化收购和并购是这一时期的特征。大型石油公司建立起品牌制度，中小石油公司则积极发展炼油业务，加油站的经营模式逐步定型。
1947年，美国加州的一独立加油站经营者George Ulich，开发出一种全新的加油理念——客户自助服务。这一年，Ulich在洛杉矶开设了3个自助式油站，随后，就有两家竞争者加入了这一行列，并持续至今的影响了这一行业50多年的变革。Ulich声称自助式加油可以在短到2.5分钟的时间内完成加油，真正做到了让加油者快速地进入和驶出。
不久，客户自助服务销售模式很快在全美流行，加油站经营者原来热衷的检查发动机油位、擦洗车窗的全程服务模式受到严峻挑战，而开始了24小时自助服务模式。于是许多油站开始减员，只雇佣几个姑娘穿行在加油岛和油机之间进行收款，而加油站的其他服务，比如打气、加水等都被重新设置到其他的位置，客户在加完油后可以到那里自行服务。
美国的24小时营业的加油站很快就得到了客户的认可，平均每月的销售量可超过100,000加仑，而当时其他的加油站每月的平均销量只有10,000加仑。这种新的自助模式开创了加油站运营的新纪元。
同时，在一座加油站里集中加油、超市、健康美容、汽车修理、配件及运动器材等项目的超级加油站的出现，促使多元化经营成为这一时期加油站发展的主流，更成为以后加油站经营的趋势。
发展：提升品牌集中度
1956年开始，全美范围内的高速公路建设对初步成型的加油站网络进行了重组。
1959年，美国政府拨款兴建州际高速公路网，由于高速公路网的建成，许多原有老旧公路旁或远离州际公路的车流量都大幅下降，大批加油站门庭冷落，被迫关闭或改行。石油公司开始在高速公路沿线建设新的加油站，使整个加油站网络跟随着高速公路的发展进入了新一轮的重组。
1960年，环境保护运动的先声—“美化美国”运动，迫使石油公司耗费大量人力物力建造和改造“景观加油站”，目的是让加油站站房融入周边社区，因此出现了一些“别墅型加油站”，这也成为加油站发展史上的一段花絮。
60年代末，一切都以吸引顾客为目标的加油站的设计和建设模式已基本形成，站房、灯光、商标、非油品服务等规范化管理，24小时营业、自助投币加油得到普及，现代加油站品牌开始定型（如埃索、美孚等）。1973年第四次中东战争爆发，OPEC国家为了打击以色列及其支持者，使用了“石油武器”，一系列的限产、禁运、国有化和提价的措施，触发了“第一次石油危机”。
石油的短缺使那些刚刚从高速公路建设的**中生存下来的加油站面临又一次危机，由于没有油品，成千的独立加油站被迫关闭。行业分析师甚至预言6个月内所有的独立加油站都将纷纷关闭、转让或被遗弃。仅在1973年，全美就减少1万多座加油站。
两年的困难时期过后，加油站行业开始逐步恢复生机。
1977年，全美加油站总数达到历史高点26万3千座，竞争的加剧使加油站运营进入市场自然淘汰的过程。
1978年，第二次石油危机的到来更加重了加油站经营的难题，独立加油站除了依靠大型石油公司，已没有什么生存空间。极少数幸存者依靠开发便利店和多种经营，进入了一种新的经营模式——便利店加油站，这种模式一直延续至今。
这一阶段的特征是：跨国石油公司垄断了加油站市场，品牌集中度提高；大公司的抗风险能力强，中小石油公司和独立加油站纷纷倒闭；石油工业成为最赚钱的行业之一；加油站利润空间下降，只有走多元化经营的路子，靠非油品经营求生存。
革新：竞争提升高效益
1978年后，加油站开始进入新的电子时代。
五十年代，信用卡的出现和普及，给加油站的支付过程带来很大的影响，加油站开始采用电子收银机和POS系统进行支付及销售的自动管理。
七十年代，商品销售和便利店的引入，带来了商业领域的销售管理、货品管理和配送管理的概念。
八十年代，开始出现各种新技术：条码扫描仪、机端读卡机开始被普遍采用。开发于这个年代初的油罐液位监测系统，对油品库存数量进行精细化的管理，大大提高了油站进销存管理的精度，同时可以严密监视油罐可能的微小渗漏，减少了加油站泄漏的风险，一经推出，便被广泛采用。到1998年，全美加油站安装液位仪的数量超过80％。
九十年代，随着便利店商品销售在加油站经营中重要性的日渐突出，更加速了加油站管理的自动化进程。九十年代末，始于欧洲的超级市场加油站开始进入加油站运营市场。这类加油站以低价、自动化、大销量作为主要运营模式，给传统的油品运营商带来了巨大的冲击。
根据加油站发展历史，以美国为例可以得出：政府的政策、法规对这一行业的发展产生决定性的影响；汽车工业和道路交通的发展决定着行业发展的前景；石油工业的发展是行业发展的决定性因素之一；对便利性的追求是推动行业变革的主要力量；选址决定着加油站的生存寿命；规模化经营和高技术含量能有效降低成本，增加抗风险能力；自助加油、多元化经营和与其他行业融合（如超市）是发展的方向；发展客户关系、培养忠诚客户是行业发展的新课题；经营者与工作人员的素质决定着经营质量。
纵观近一百年的加油站发展历史，客户对便利性的追求是推动行业变革的主要力量。加油站运营商只有做好准备迎合快速变化的行业竞争环境，不断采用新管理模式或新技术，推出新的增值服务，提高竞争优势，才能在持续增强的竞争环境生存下来。而成功的管理模式或新技术在市场上推广速度很快，率先采用先进技术与成功模式的运营商可以享受更高的利润。
中国：阵容强大类型多
在中国，加油站经历了一个由少到多、由分散经营到规模经营、由单一经济成分向多种经济成分、由经验型管理向专业化管理、由单品种经营向多种经营转化的发展过程。
随着中国国民经济的快速发展、交通基础设施的不断改善和机动车保有量的快速增加，加油站已成为民众生活中不可或缺的一部分。石油、石化两大集团在国内南北地区形成各自的加油站分销网络后，便开始相互渗透，双方在竞争中加强联合，相互促进，共同提高。
社会各业加油站经过十几年的竞争，已成为中国加油站重要组成部分。近年来，国外跨国石油公司通过各种途径进入中国成品油零售市场，与各地方及中国石油合资经营的加油站相继在中国亮相，目前世界几大石油公司在中国都有加油站。
50年代中国加油站总量只有70座左右；60年代末不到200座；70年代末发展到600座；1985年中国加油站大约有3600多座；1990年底为5000多座；1993年猛增到38000座；1996底达到42600座。到2000年底，中国加油站总数已经达到8万多座。
截至2006年底，中国93879座加油站中，中石油自营及特许加油站数量为18207座(其中自营站16906座，特许站1301座)，较2005年增加43座，占中国加油站总数的19.4%；中石化自营及特许加油站数量为28801座(其中自营站28001座，特许站800座)，较2005年减少846座，占中国加油站总数的30.7%；其他国有、民营、外资加油站共计46871座，占中国加油站总数的49.9%。
2007年，中国的93879座加油站中，中石油自营及特许加油站数量为18207座(其中自营站16906座，特许站1301座)，较2005年增加43座，占中国加油站总数的19.4%；中石化自营及特许加油站数量为28801座(其中自营站28001座，特许站800座)，较2006年减少846座，占中国加油站总数的30.7%；其他国有、民营、外资加油站共计46871座，占中国加油站总数的49.9%。
第四篇：基因工程的现状发展及展望
基因工程的现状发展及展望
课程：食品生物技术 专业： 班级： 学号： 姓名：
完成时间：2011 年5月25日
基因工程的现状发展及展望
【摘要】从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。
【关键词】基因工程技术；生物反应器；基因治疗
基因工程的发展史
1860至1870年 奥地利学者孟德尔根据豌豆杂交实验提出遗传因子概念，并总结出孟德尔遗传定律。
1909年 丹麦植物学家和遗传学家约翰逊首次提出“基因”这一名词，用以表达孟德尔的遗传因子概念。
1944年 3位美国科学家分离出细菌的DNA（脱氧核糖核酸），并发现DNA是携带生命遗传物质的分子。
1953年 美国人沃森和英国人克里克通过实验提出了DNA分子的双螺旋模型。
1969年 科学家成功分离出第一个基因。
1990年10月 被誉为生命科学“阿波罗登月计划”的国际人类基因组计划启动。
1998年 一批科学家在美国罗克威尔组建塞莱拉遗传公司，与国际人类基因组计划展开竞争。
1998年12月 一种小线虫完整基因组序列的测定工作宣告完成，这是科学家第一次绘出多细胞动物的基因组图谱。
1999年9月 中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组全部序列的1%。中国是继美、英、日、德、法之后第6个国际人类基因组计划参与国，也是参与这一计划的惟一发展中国家。
1999年12月1日 国际人类基因组计划联合研究小组宣布，完整破译出人体第22对染色体的遗传密码，这是人类首次成功地完成人体染色体完整基因序列的测定。
2000年4月6日 美国塞莱拉公司宣布破译出一名实验者的完整遗传密码，但遭到不少科学家的质疑。
2000年4月底 中国科学家按照国际人类基因组计划的部署，完成了1%人类基因组的工作框架图。
2000年5月8日 德、日等国科学家宣布，已基本完成了人体第21对染色体的测序工作。
2000年6月26日 科学家公布人类基因组工作草图，标志着人类在解读自身“生命之书”的路上迈出了重要一步。
2000年12月14日 美英等国科学家宣布绘出拟南芥基因组的完整图谱，这是人类首次全部破译出一种植物的基因序列。
2001年2月12日 中、美、日、德、法、英6国科学家和美国塞莱拉公司联合公布人类基因组图谱及初步分析结果。
科学家首次公布人类基因组草图“基因信息”。
一、基因工程应用于植物方面
农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。
由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了
不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，大大提高了营养价值，得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。1
二、基因工程应用于医药方面
目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。
目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂，最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒，修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中，是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。
三、基因工程应用于环保方面
工业发展以及其它人为因素造成的环境污染已远远超出了自然界微生物的净化能力，已成为人们十分关注的问题。基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。美国利用DNA重组技术把降解芳烃、萜烃、多环芳烃、脂肪烃的4种菌体基因链接，转移到某一菌体中构建出可同时降解4种有机物的“超级细菌”，用之清除石油污染，在数小时内可将水上浮油中的2/3烃类降解完，而天然菌株需1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢杆菌、且表达成功。它能钉死蚊虫与害虫，而对人畜无害，不污染环境。现已开发出的基因工程菌有净化农药的DDT的细菌、降解水中的染料、环境中有机氯苯类和氯酚类、多氯联苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸药的工程菌及用于吸附无机有毒化合物(铅、汞、镉等)的基因 1
工程菌及植物等。90年代后期问世的DNA改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同细菌的基因通过PCR技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级菌株，从而大大地提高降解效率。2
四、分子进化工程的研究
分子进化工程是继蛋白质工程之后的第三代基因工程。它通过在试管里对以核酸为主的多分子体系施以选择的压力，模拟自然中生物进化历程，以达到创造新基因、新蛋白质的目的。
这需要三个步骤，即扩增、突变、和选择。扩增是使所提取的遗传信息DNA片段分子获得大量的拷贝；突变是在基因水平上施加压力，使DNA片段上的碱基发生变异，这种变异为选择和进化提供原料；选择是在表型水平上通过适者生存，不适者淘汰的方式固定变异。这三个过程紧密相连缺一不可。
现在，科学家已应用此方法，通过试管里的定向进化，获得了能抑制凝血酶活性的DNA分子，这类DNA具有抗凝血作用，它有可能代替溶解血栓的蛋白质药物，来治疗心肌梗塞、脑血栓等疾病。
3五、前景展望
由于基因工程运用DNA分子重组技术，能够按照人们预先的设计创造出许多新的遗传结合体，具有新奇遗传性状的新型产物，增强了人们改造动植物的主观能动性、预见性。而且在人类疾病的诊断、治疗等方面具有革命性的推动作用，对人口素质、环境保护等作出具大贡献。所以，各国政府及一些大公司都十分重视基因工程技术的研究与开发应用，抢夺这一高科技制高点。其应用前景十分广阔。我国基因工程技术尚落后于发达国家，更应当加速发展，切不可坐失良机。但是，任何科学技术都是一把“双刃剑”，在给人类带来利益的同时，也会给人类带来一定的灾难。比如基因药物，它不仅能根治遗传性疾病、恶性肿瘤、心脑血管疾病等，甚至人的智力、体魄、性格、外表等亦可随意加以改造；还有，克隆技术如果不加限制，任其自由发展，最终有可能导致人类的毁灭。还有，尽管目前的转基因动植物还未发现对人类有什么危害，但不等于说转基因动植物就是十分安全的，毕竟这些东西还是新生事物，需要实践慢慢地检验。转基因生物和常规繁殖生长的品种一样，是在原有品种的基础上对其部分性状进行修饰或增加新 2
3性状，或消除原来的不利性状，但常规育种是通过自然选择，而且是近缘杂交，适者生存下来，不适者被淘汰掉。而转基因生物远远超出了近缘的范围，人们对可能出现的新组合、新性状会不会影响人类健康和环境，还缺乏知识和经验，按目前的科学水平还不能完全精确地预测。所以，我们要在抓住机遇，大力发展基因工程技术的同时，需要严格管理，充分重视转基因生物的安全性。
六、基因工程技术的发展方向
1、开发针对神经系统、肿瘤、心血管系统、艾滋病及免疫缺陷等重大疾病的多肽、蛋白质和核酸等新生物技术产品；
2、选择一批市场前景好的生物技术产品及疫苗、诊断用单克隆抗体，开发重点是乙肝基因疫苗与单克隆抗体诊断试剂等；
3、开发靶向药物主要是开发抗肿瘤药物。目前治疗肿瘤药物确实存在一个所谓“敌我不分”的问题。在杀死癌细胞的同时，也杀死正常细胞。导向治疗就是针对这个问题提出来。所谓导向治疗就是利用抗体寻找靶标，如导弹的导航器，把药物准确引入病灶，而不伤及其他组织和细胞；
4、人源化的单克隆抗体的研究开发。抗体可以对抗各种病原体，亦可作为导向器，但目前的单克隆抗体，多为鼠源抗体，其本身也被异种生物体视为抗原，当被注入人体后会诱导产生抗体（抗抗体）或激发免疫反应。目前国外已研究噬菌体抗体技术，嵌合抗体技术，基因工程抗体技术以解决人源化抗体问题；
5、血液替代品的研究与开发仍然占重要地位。血液制品是采用大批混合的人体血浆制成的，由于人血难免被各种病原体所污染，如艾滋病病毒及乙肝病毒等，通过输血而使接受输血的人感染艾滋病或乙型肝炎的案例时有发生，因此利用基因工程开发血液替代品引人注目。4
六、我国的生物技术前景
今天，人们借助于所谓的DNA切片已能同时研究上百个遗传基质。基因的研究达到了这样一个发展高度，几年后，随着对人类遗传物质分析的结束，人们开始集中所有的手段对人的其他部分遗传物质的优缺点进行有系统地研究。但是，生物学的发展也有其消极的一面：它容易为种族主义提供新的遗传学方面的依据对新的遗传学持批评态度的人总喜欢描绘出一幅可怕的景象：没完没了的测试、操纵和克隆、毫无感情的士兵、基因很完美的工厂工人……遗传密码使基因 4
研究人员能深入到人们的内心深处，并给他们提供了操纵生命的工具。然而他们是否能使遗传学朝好的研究方向发展还完全不能预料。
改革开放以来，我国相继开展了分子遗传学、基因工程、细胞融合、酶工程等新学科新技术的研究，现代生物技术得到快速发展，并在农业和医药等领域获得广泛的应用，现代生物技术产业初具规模。进入新世纪以来，随着人类和其它物种基因研究的不断深入，信息技术、新材料技术等其它新兴学科和技术的交叉和渗透，生物芯片、生物信息、组织工程、干细胞研究等一系列新兴领域和技术不断涌现，生物技术的发展进入了一个新阶段。生物技术为经济社会的发展作出了重要贡献。
医药生物技术为提高人民平均寿命和健康水平发挥了重要作用。中国人均寿命从1949年的35岁增长到1996年的70．8岁左右，生物技术功不可没。近年来，中国医药生物技术发展明显加快。进入临床研究的生物医药已达150多个，有基因工程干扰素等21种生物技术药物投入生产，生物医药制品2000年销售额已达200多亿元，14年增长了近百倍。
农业生物技术成就显著，为提高农产品产量和质量，增加农民收入作出了重要贡献。我国首创的杂交水稻已推广到20多个国家，累计增产粮食3500多亿公斤，国际权威杂志《SCIENCE》撰文认为，中国的杂交水稻填满了亚洲人的饭碗。在此基础上，中国超级杂交水稻研究又取得新的突破，每公顷产量突破了12吨，国际上提出的超级稻指标首先在中国实现。我国是世界上第二个在转基因抗虫棉有自主知识产权的国家，2002年种植面积占棉花面积的40％，5年来累计为农民增收50多亿元。
在能源、环境、工业生物技术方面取得明显进展，在利用生物技术开发可再生清洁能源方面更是成就显著。利用玉米等粮食生产燃料酒精的技术在河南、黑龙江已分别具备数十吨的年生产能力，乙醇汽油已在部分地区推广试用；日产量20余吨的生物柴油生产企业2002年已在四川问世，填补了我国生物柴油工业化生产的空白。我国在世界上首次完成了生物制氢中试研究。
生物技术基础研究方面不断取得突破，为生物技术创新和产业化奠定了良好基础。中国作为惟一的发展中国家成员参与国际人类基因组计划，完成了1％的测序工作；中国科学家独立完成了杂交水稻父本9311（籼稻）的基因组测序草图；在国际上首次定位和克隆了神经性高频耳聋基因、乳光牙本质Ⅱ型、汗孔角化症等遗传病的致病基因。
生物技术产业发展迅速，初具规模。经过近20年的发展，中国的生物技术与产业已开始从跟踪仿制到自主创新的转变。中国涉及现代生物技术的企业约500家，从业人员超过5万人，其中涉及医药生物技术的企业300多家。北京、上海、广州、深圳等地已建立了20多个生物技术园区，目前已培育了一大批新企业，在中国生物技术发展中起着龙头的带动作用。
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02期
[4] Bernhard J.Ralph, 朱金贵.生物工艺学当前发展水平[J].世界科学, 1980,(03)
第五篇：基因工程
《基因工程论文》
嗜热解烃基因工程菌SL-21的构建
学
院：生命科学学院 班
级：生物技术12-2 学
号：7011208209 姓
名：陈 昆 任课教师：张锐
嗜热解烃基因工程菌SL-21的构建
摘要﹕从以C15—C36直链烷烃为惟一碳源生长的解烃菌———地芽孢杆菌MD-2细胞中获得了1个新的烃降解基因———烷烃单加氧酶基因sladA。将基因sladA克隆到质粒pSTE33上,构建了重组质粒pSTalk。通过电转化将pSTalk转化入嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3内,构建了基因工程菌SL-21。SL-21兼具嗜热和解烃的功能,在70℃条件下,14d后对原油的降解率达75.08%。研究结果表明,可以通过体外重组的方式向嗜热菌中引入烃降解基因,从而构建嗜热解烃基因工程菌。关键词:微生物采油;烃类降解菌;嗜热解烃基因;质粒;基因工程菌
微生物降解原油是微生物提高原油采收率的主要机理之一。研究结果表明,在解烃菌作用下原油的族组分发生变化,轻质组分增加,粘度下降,改善了原油的流动性;同时,解烃菌还可以将烃类分子转化成有机溶剂、表面活性剂、酸和气体等驱油物质。迄今为止,从自然界筛选的高效解烃菌绝大多数为嗜温微生物,最适合生长温度一般为20-45℃,很难适应油藏的高温环境。笔者从1株解烃菌细胞中分离出1个新的烃降解基因———烷烃单加氧酶基因sladA,并采用基因工程手段将此基因转化到另外1株最适合生长温度为70℃的嗜热菌体内,构建了嗜热解烃基因工程菌SL-21。该基因工程菌既具有高效的解烃功能,又能适应油藏高温环境,在微生物采油中具有良好的应用前景。1.1 实验材料
实验材料包括限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ;UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、PCR片断回收试剂盒;大肠杆菌感受态细胞E.coliDH5α;pGEM-T easy载体;质粒pSTE33 kanr,Ampr,EcoRⅠ/XhoⅠ;异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、十二烷基硫酸钠(SDS)、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)。LB培养基按文献配制。无机盐培养基组成:Na2HPO40.06g;KH2PO40.02g;NaNO30.2g;CaCl20.001g;FeSO40.001g;MgSO4 0.03g;蒸馏水100mL;pH值为7.2。嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3,分离自胜利油区孤岛油田中一区馆3区块采出液,最适合生长温度为70℃;地芽孢杆菌MD-2,以C15—C36直链烷烃为惟一碳源生长,分离自胜利油区原油污染土壤。1.2 实验方法
DNA的操作 基因组DNA小量提取,利用聚合酶链式反应(PCR)对DNA扩增、PCR产物的回收、酶切与连接,质粒DNA提取和基因序列测定等均按文献[13-14]方法进行。菌株培养 所涉及到的菌株培养均在温度为70℃,转速为180r/min的条件下进行振荡培养。基因工程菌的构建和筛选方法 ZJ-3感受态细胞的制备按文献[13-14]方法进行。用构建的重组质粒pSTalk在最佳条件下电转化ZJ-3感受态细 胞构建基因工程菌。在含有50μg/mL Kan的LB琼脂平板上挑选10个阳性克隆接种到5mL LB培养基中,培养过夜,获得种子液。将该种子液接种到200mL以液蜡为惟一碳源的无机盐培养基中,培养5d后用CCl4抽提剩余的液蜡,用红外测油仪测定烃的剩余量,根据菌株降解液蜡的速率筛选出目的基因工程菌。基因工程菌的诱导表达及SDS-PAGE检测挑取阳性克隆接种于含100μg/mL Amp的10mL的LB液体培养基中,180r/min下振荡培养至光密度值达到0.6(检测光波波长为600nm),加诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L,振荡培养8h,收集表达菌体,加SDS上样缓冲液,于100℃水浴10min后上样,用12%的SDS-PAGE电泳检测。基因工程菌降油能力测试 将基因工程菌接入20mL LB培养基中,培养12h,以5 000r/min的速度离心5min收集菌体,用无菌生理盐水洗涤菌体1次,加20mL无菌生理盐水悬浮,作为菌株利用烷
烃生长的种子液。取菌悬液按1%接种量接入200mL无机盐培养基中,加入2%孤岛油田中一区馆3区块原油或2%的液体石蜡作为惟一碳源培养,取样稀释涂布计数。原油降解实验 在无机盐培养基中添加2%的原油,按1%接种量接入基因工程菌,培养14d。用正己烷萃取降解后的原油,用气相色谱仪测定原油饱和烃组分的降解情况。原油降解率为菌株降解前、后原油量的差值与菌株降解前原油量的比值。2 实验结果与分析
2.1 MD-2基因组DNA的检测
对MD-2基因组进行提取和纯化。提取后的染色体DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,相对分子质量不小于23kb,说明提取的DNA完好。在检测光波波长为260280nm条件下分别测出DNA的光密度,其比值为1.95,换算出DNA的质量浓度为1 400g/mL,表明DNA纯度较好,无蛋白、RNA、酚和多糖物质的干扰。2.2 烷烃单加氧酶基因的克隆与序列分析依据美国国立卫生研究院基因序列数据库(Genbank)中的烷烃单加氧酶基因开放阅读框两端保守序列,设计了一对兼并引物以MD-2基因组DNA为模板进行PCR扩增,将约1.3kb的PCR产物回收后连接到pGEM-T easy载体上,转入E.coliDH5α,挑取阳性克隆质粒进行测序。测序结果经Genbank检索,表明该DNA序列是个新的烷烃单加氧酶基因,命名为sladA。2.3 基因工程菌的构建及筛选
通过PCR扩增sladA后,将PCR产物用EcoRⅠ或XhoⅠ消化,分离纯化出1 329bp的片断,与经EcoRⅠ或XhoⅠ消化的pSTE33质粒连接,构建成含sladA的重组质pSTalk。经电泳鉴定表明(图1),重组质粒构建成功。
2.4 基因sladA在基因工程菌SL-21中的诱导表达
由基因工程菌SL-21全蛋白的SDS-PAGE图谱可见(图2),在烷烃单加氧酶基因sladA对应蛋白大小的地方扫描到高信号强度,表明sladA基因在SL-21中得以表达。2.5 基因工程菌SL-21碳源生长
基因工程菌SL-21在以原油和液体石蜡为惟一碳源的无机盐培养基中培养,在70℃和180r/min条件下,经过3d的延滞期后进入对数期,菌体数增加。17d后,菌体数为接菌初期的5倍,表明SL-21能够利用原油或液体石蜡作为惟一碳源生长。2.6 对原油的降解作用
由原油饱和烃组分的降解情况可看出(图3),基因工程菌对原油有很明显的降解效果,几乎将饱和烃降解完全。经对气相色谱各峰面积对比,计算出各峰面积的含
量和饱和烃组分降解率(表2)。基因工程菌SL-21对原油的降解率为75.08%。
实验结果表明,烃类降解菌地芽孢杆菌MD-2细胞提取的烷烃单加氧酶基因sladA可以在嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3中表达。但不同的基因工程菌株中烷烃单加氧酶基因sladA表达的效率不同,需要通过菌株对原油的降解评价进一步筛选。获得的对原油降解速率最高的基因工程菌SL-21能在70℃高温条件下生长,并且对原油降解效果明显。因此以体外重组方式向嗜热菌中引入烃类降解基因构建嗜热解烃基因工程菌在技术上是可行的。3 结论
以地芽孢杆菌MD-2为目标菌株,克隆和表达了降解长链烷烃的单加氧酶基因sladA,并在嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3中正确表达了基因sladA,构建了基因工程菌SL-21。基因工程菌SL-21在70℃条件下,能以原油或液体石蜡为惟一碳源生长。14d对原油的降解率为75.08%,对原油饱和烃组分均有明显的降解效果。该基因工程菌既可以用于微生物驱油技术,又可以用于高温油田污水的生物处理。利用基因工程的方法可以获得既能耐受极端环境,又具有良好功能的基因工程菌株,是石油微生物菌种选育的重要方向。参考文献: [1] 周金葵,王大威,廖明清,等.一株石油烃降解菌的筛选及性能研究[J].大庆石油地质与开发,2007,26(6):119-123.[2] 汪卫东,汪竹,耿雪丽,等.美国微生物采油技术现场应用效果分析[J].油气地质与采收率,2002,9(6):75-76.[3] 袁长忠,宋永亭,段传慧.微生物采油用营养物质在石英砂上的静态和动态吸附规律[J].油气地质与采收率,2009,16(4):74-76.[4] 修建龙,董汉平,俞理,等.微生物提高采收率数值模拟研究现状[J].油气地质与采收率,2009,16(4):86-89.[5] 路璐,向廷生,黑花丽.本源微生物降解原油的饱和烃色谱分析[J].油气地
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