第一篇：分子生物学与基因工程结课论文
《分子生物学与基因工程》
结课论文
Real-Time PCR在分子生物学中的应用
姓
名：XXX 学
号：AXXXXXXX 院
系：生命科学学院 班
级：生科XXX班 任课教师：XXX
二零一二年十二月 Real-Time PCR在分子生物学中的应用
XXX XXX大学生命科学学院 黑龙江哈尔滨 150xxx
摘 要：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）可对特定基因进行扩增，因此被广泛应用于分子生物学领域中获取特定基因或基因片段。定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时定量PCR（real-time quantitative PCR）。该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，且与常规PCR相比，它具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点，目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，成为了分子生物学研究中的重要工具。关键词：实时定量PCR；基因扩增；分子生物学
1971年Khorana等最早提出PCR理论：―DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA 基因‖。因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Smith等已发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，Khorana 等的早期设想被忽视。1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶 ⅠKlenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功以及1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq酶）引入PCR，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序,最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的应用和普及。
自从PCR技术问世便很快成为科研、临床诊断的热点技术。但是传统PCR技术在应用中一是不能准确定量，二是容易交叉污染，产生假阳性。直到1996年由美国Applied Biosystems公司推出的实时荧光定量PCR技术，上述问题才得到较好的解决[1]。实时荧光定量PCR（real-time fluoro-genetic quantitative PCR，FQ-PCR）是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域[2]。
1.实时荧光定量PCR技术概述
1.1 实时荧光定量PCR原理
1992年Higuchi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，荧光探针技术是基于标记基团的FRET原理而实现的，当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。在探针5’端标记一个报告基团（R），在3’端标记一个淬灭基团（quencher，Q），两者距离很近时（7-10nm），报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸收，并依赖其较高的S/N比值（信-噪比, signal-to-noise ratio）和良好的辨别能力进行定量检测。
荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（threshold value）。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。[4][3]1.2 常用实时荧光定量PCR分类
1.2.1 实时荧光定量PCR荧光染料法
实时荧光定量PCR荧光染料法包括非饱和染料SYBR Green法和饱和染料LC Green法[5]。非饱和染料SYBR Green染料法定量成本低，方法简便，不需要设计探针，但是特异性低。荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。饱和染料LC Green法与SYBR染料法工作原理是一样的，但与传统的荧光染料SYBR Green相比有如下优点：LC Green染料在进行PCR 时可以以饱和的浓度加入，不会抑制PCR反应，而Sybr Green 染料浓度过高会抑制PCR反应。从而，利用LC Green染料可以进行高分辨率熔解曲线分析。在进行HRM分析时，由于饱和染料占据了DNA双链上每一对碱基上的空位，所以在双链解链时，染料立即与双链脱离，使得荧光信号发生较大的变化，而非饱和染料常发生位置上的迁移，从而对荧光信号没有大的影响。除LC Green染料外，常用的染料还有Reso Light、Ever Green等，这些都是绿色荧光染料，最佳激发波长范围440-470nm，发射荧光波长470-520nm。
1.2.1 实时荧光定量PCR探针法
实时荧光定量PCR寡核苷酸探针法包括TaqMan探针法和TaqMan-MGB探针法。TaqMan 探针法技术原理是利用Taq酶的5’—3’外切酶活性，在传统PCR技术一对特异性引物的基础上增加了一条荧光双标记探针。该探针可与上、下游引物之间的DNA模板序列特异性结合。探针的5’端标以荧光报告基团，3’端标以荧光淬灭基团。在PCR退火复性期，探针与DNA模板特异性结合。在PCR延伸阶段，Taq酶在引物的引导下，沿着模板合成新链，当移动至探针结合的位置时便发挥其5’—3’外切酶活性将探针降解成单核苷酸，使得荧光报告基团与淬灭基团分离，前者的荧光信号释放并被检测。因此，每合成一条新链就有一个探针被裂解并释放出一个荧光信号。荧光信号强度与PCR产物量相对应。
MGB探针与传统的TaqMan探针比较，有很大的优势。它可以使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列的 MGB探针的设计有很大的帮助；同时可以提高配对与非配对模板间的Tm值差异； 由于在探针的3’端的Quencher基团为不发光的荧光基团，并且与Report基团在空间的位置更接近，使杂交的稳定性大大提高，实验的结果更精确，分辨率更高，可 以进行SNP分析。MGB探针实验步骤简单，使杂交的重复性大大提高。
1.3 实时荧光定量PCR定量方法
在实时荧光PCR中，模板的定量有两种方法：绝对定量和相对定量。绝对定量指用已知的标准曲线来推算未知的样本量；相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化。由于每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始DNA浓度的标准品可做出标准曲线。
1.3.1 绝对定量法
该方法是利用标准品作一条标准曲线，通过标准曲线对样本进行定量。绝对定量标准品一般是用质粒DNA或是PCR扩增产物等制备的。标准品的量根据260nm的吸光度值计算得出。由于样本的浓度完全是通过标准曲线来确定，所以合适的标准品是定量准确的关键。一方面标准品与未知样本应具有一致的扩增效率，另一方面标准品的定量必须准确。这就要求标准品的扩增序列与样本完全一致，制备的标准品纯度要高，不应含有影响定量的因素如Dnase、标准品与未知样本各自反应体系内的干扰因素要一致等。该方法的优点就是测定范围很广（10～1010拷贝），结果可直接通过软件得出，不需额外计算。1.3.2 相对定量法
相相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因，该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较、反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素，通常选用的管家基因有GAPDH、β-2微球蛋白和rRNA。使用的β-actin、相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量，再将目的基因同管家基因的比值作为定量的最后结果。此种方法计算出未知样品的量是相对于某个参照物的量而言，因此，相对定量的标准曲线比较容易制备，对于所用的标准品只需知道其稀释度即可。在整个试验中，待测样品的量来自于标准曲线，最终必须除以参照基因的量，即参照基因是1×的样本，其他的样本为参照基因的n倍。由于管家基因在各种组织中的恒定表达，所以可用管家基因的量来作为标准，以比较来源不同的样本，目的基因表达量的差异，此即相对定量。这一方法的缺陷是要求外参、目的基因和管家基因的扩增效率一致；此外加入已知起始拷贝数的内标相当于是进行双重PCR反应，存在两种模板相互的干扰和竞争[7]。
1.3.3 相对定量反应循环值（Ct）比较法
[6]即ΔCT值法，该方法是同时扩增待测靶基因片段和一个作为内参照的基因片段，一般是一个内源性管家基因片段。这两个扩增反应可在2管中分别进行，也可在同一反应管中进行，测得两者的CT值之差，即ΔCT。该方法不需要标准曲线。它是根据PCR扩增反应的原理，假设每个循环增加倍的产物数量PCR反应的指数期得到扩增产物的值来反映起始模板的量通过数学公式来计算相对量。比较Ct法与标准曲线法的相对定量的不同之处在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到Ct值来反应起始模板的量，一个循环（Ct=1）的不同相当于起始模板数2倍的差异。比较不同待测标本DNA的ΔCT值与正常标本DNA的ΔCT值的变化，即可对未知标本靶基因的原始拷贝数作出判断，从而对病理状态进行判断或诊断。但是此方法是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计[8]。最终结果也是靶序列和参考品的相对比值。该方法需确定靶序列和参考品的扩增效率是否一致；如不一致，则会影响结果的准确性。
2.实时荧光定量PCR技术的应用
实时定量PCR的应用非常广泛。在科研方面，可定量分析各种基因的表达[ 9 ]、分析基因变和多态性[ 10 ]、分析细胞因子的表达
[ 11 ]、单核苷酸多态性（SNP）
[ 12 ]
测定及易位基因的检测
[ 15 ]
[ 13 ]
等；在医疗方面，可用于免疫组分分析
[ 14 ]、临床疾病早期诊断、病原体检测、耐药性分析
[ 16 ]、肿瘤研究[ 17 ]和微小残留病变（MRD）[ 18 ]检测等。
以下就其在基因工程研究、病原体的检测和肿瘤分子诊断等方面的应用及其新进展作一简述。2.1 基因工程研究领域
实时荧光定量技术的出现不仅加强了有关对基因的量的研究方法，而且也加强了对基因的质所发生变化的研究。它可以检测基因突变和基因组的不稳定性，已经被广泛应用于遗传分析[19]。
2.1.1
基因表达研究
由不同的荧光报告基团标记的探针分别与野生型和突变基因杂交，探针杂交的效率和其后的切除与杂交有关。如果一种染料的荧光信号明显强于另一种，说明它是一个纯合子，如果荧光信号都增加则表明是一个杂合子。从使用范围来看，它能用于检测已知基因序列的任何遗传病基因的突变和缺失及表达量的异常，从灵敏度方面看，它能从单细胞进行特异基因扩增，实现植入前基因诊断。PCR技术还可用于端粒酶的检测。使用双色荧光标记探针，结合不同的引物设计，可以实现对某些先天性疾病的定量检测。应用实时荧光定量PCR方法对β地中海贫血症（β地贫）患者β与γ球蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地贫的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。迄今对遗传性物质改变引起的疾病还无法根治，只能通过产前监测和产前基因诊断，减少病婴出生[20]
。因此，实时荧光定量PCR方法可用于产前监测和产前基因诊断。
2.1.2
单核苷酸多态性（SNP）及突变分析
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。实时荧光定量PCR一个诱人的应用前景是用于检测基因突变和基因组的不稳定性[21]。基因突变的检测基于两条探针，一条探针横跨突变位点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂交。两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序列中无突变，探针杂交便完全配对，如有突变，则探针与靶序列不完全配对，会降低杂交体的稳定性，从而降低其熔解温度（Tm）。这样便可对突变和多态性进行分析。
2.1.3
转基因研究
Tesson等确定了实时定量PCR的技术条件，利用两种发光探针及适当的循环域值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因，以分析转基因鼠的接合性[22]。同型结合的和异质接合的动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律，通过实时定量PCR检测，该方法为转基因动物的同型结合及异质接合提供了明确的鉴定结果。这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将有很大用途。
2.2 肿瘤的分子诊断
肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化，是一种多基因异常的疾病，这些异常变化用实时荧光定量PCR方法都可以检测出来。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病ER基因、肿瘤MDR1基因等，尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全阐明，但相关基因的遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因之一已得到普遍承认[23]。癌基因的突变和表达增加，在许多肿瘤早期就出现。实时荧光PCR技术不仅能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。如定量结直肠癌淋巴结的癌胚抗原(CEA)mRNA的表达量，可作为诊断癌症微转移的重要依据[24]。目前，肿瘤患者的生存期已有所延长，但是缓解期的患者仍存在复发的危险，因此，微小残留病变的检测对于进一步调整治疗方案至关重要。实时荧光PCR技术正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备工具[25]。Eckert等提出采用实时荧光PCR技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微残留病灶，对儿童急性白血病的治疗有重要指导意义。
2.3 病原体的分子检测
目前，用此方法还进行了对人类结核杆菌、免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、巨细胞病毒、EB病毒等病原体的检测[26]。同样在国内，2004年针对SARS流行性病的检测和诊断使得荧光定量PCR技术得以应用和发展。荧光定量PCR问世后的几年中，积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生、发展和预后之间关系的资料，这些研究资料不断丰富，将形成感染性疾病的临床分子诊断标准。目前, 实时荧光PCR技术已应用于肝病、性病以及人类免疫缺陷病毒（HIV）等各种病原体的临床诊断，为实现快速准确诊断提供了有效的检测方法。
3.小结
时荧光定量PCR与其他一些技术的结合应用，是今后发展的方向，如与高级微型解剖技术结合后，能提高形态学损伤所至低水平扩增的检测能力[ 27 ]、可定量分析石蜡包埋储存样本中的核酸[ 28]及少量细胞中的全部转录产物[ 29 ]等。此外，微阵列实验中所选基因表达水平的测定仍需使用实时PCR技术[ 30 ,31 ]，利用该技术还可使等位基因特异表达分析以及生化武器证据甄别成为可能。
通过设计针对目的基因的特异性引物和探针，并优化反应体系和反应循环参数，已成功地建立了快速、灵敏、特异的Q-PCR检测方法。可实现大量样本同时检测，并节省大量试验时间和反应成本，为基因定量检测和准确定量疾病相关基因的表达提供了有效的技术手段；同时实现对人类和动物疾病的早期诊断与基因分期、分型，以及对人类肿瘤转移的早期发现及预后判断[32]。因此Q-PCR技术将成为未来分子生物学实验室必备的研究工具，在临床上将有更加广阔的应用前景。
参考文献：
[1] Clegg RM.Fluorescence resonance energy transfer.Curr Opin Biotechnol, 1995, 6(1):103-110 [2] Mikael KA, Jose MA, Martin B, et al.The real-time polymerase chain reaction.Molecular Aspects of Medicine, 2006, 27: 95–125 [3] Walsh PS, Erlich H A, Higuchi R.Preferential PCR amplification of alleles: mechanisms and solutions.Genome Res.1992, 1:241-250 [4] 欧阳松应, 杨冬, 欧阳红生, 马鹤雯.实时荧光定量PCR技术及其应用.生命的化学, 2004, 24(1):74-76 [5] Bengtsson M, Karlsson HJ, Westman G, et a1.A new minor groove binding asymmetric cyanine reporter dye for real-time PCR.Nucleic Acids Res, 2003, 31(8):e45 [6] Galbiati S, Smid M, Gambini D, et al.Fetal DNA detection in maternal plasma throughout gestation.Hum Genet, 2005, 117(2-3): 243-248 [7] Robert M W, Stella L, Michael G, et al.Measurement of Epstein barr virus DNA loads in whole blood and plasma by TaqMan PCR and in peripheral blood lymphocytes by competitive PCR.J Clin Microbiol, 2003, 41 : 5245-5249 [8] Magnus L, Charles H.Dynamic range and reproducibility of hepatitis B virus(HBV)DNA detection and quantification by cobas Taqman HBV, a real-time semiautomated assay.J Clin Microbiol, 2005, 43: 4251-4254 [9] Hirayama Y , Sakamaki S, Matsunaga T, et al.Concentrations of thrombopoietin in bone marrow in normal subjects and in patients with idiopathic thrombocytopenic purpura, aplastic anemia, and essential thrombocythemia correlate with its mRNA expression of bone marrow stromal cells.Blood, 1998, 92(1):46-52 [10] Kyger EM, Krevolin MD, Powell MJ.Detection of the hereditary hemochromatosis gene mutation by real-time fluorescence polymerase chain reaction and peptide nucleic acid clamping.Anal Biochem, 1998, 260(2):142-148 [11] Ueda M, Imada K, Imura A, et al.Expression of functional interleukin-21 receptor on adult T-cell leukaemia cells.Br J Haematol, 2005, 128(2):169-176 [12] Johnson VJ, Yucesoy B, Luster MI.Genotyping of single nucleotide polymorphisms in cytokine genes using real-time PCR allelic discrimination technology.Cytokine, 2004, 27(6):135-141 [13] Taube T, Eckert C, Korner G ,et al.Real-time quantification of TELAML1 fusion transcripts for MRD detection in relapsed childhood acute lymphoblastic leukaemia.Comparison with antigen receptor-based MRD quantification methods.Leuk Res, 2004, 28(7):699-706 [14] Lang R, Pfeffer K, Wagner H, et al.A rapid method for semiquantitative analysis of the human V beta-repertoire using TaqManR PCR.J Immunol Methods, 1997, 203(2):181-192 [15] Swan DC, Tucker RA, Holloway BP, et al.A sensitive, type-specific, fluorogenic probe assay for detection of human papillomavirus DNA.J Clin Microbiol, 1997, 35(4):886-891 [16] Piatek AS, Tyagi S, Pol AC, et al.Molecular beacon sequence analysis for detecting drug resistance in Mycobacterium tuberculosis.Nat Biotechnol, 1998, 16(4): 359-363 [17] Cheung IY, Cheung NK.Quantitation of marrow disease in neuroblastoma by real-time reverse transcription-PCR.Clin Cancer Res, 2001, 7(6):1698-1705 [18] van der Velden VH, Boeckx N, van Wering ER, et al.Detection of minimal residual disease in acute leukemia.J Biol Regul Homeost Agents, 2004, 18(2):146-154 [19] Hwa HL, Ko TM, Yen ML, et al.Fetal gender determination using real-time quantitative polymerase chain reaction analysis of maternal plasma.J Formos Med As-soc, 2004, 103(5)：364-368 [20] UenoH, Yoshida K, Hirai T.Quantitative detection of carcinoembryonic antigen messenger RNA in the peritoneal cavity of gastric cancer patients by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction.Anticancer Res, 2003, 23(2C):1701-1708 [21] Nieuwenhuis EJ , Jaspars LH, Castelijns JA, et al.Quantitative molecular detection of minimal residual head and neck cancer in lymph node aspirates.Clin Cancer Res, 2003, 9(2):755-761 [22] Liew M, Pryor R, Palais R, et al.Genotyping of single nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons.Clin Chem, 2004, 50(7):1156-1164 [23] Piet A, van Rijn, Gerard JW, et al.Detectionof economically important viruses in boar semen by quantitative Real Time PCR technology.Journal of Virologica1 Methods, 2004, 120:151-160 [24] Andersen CL, Jensen JL, Orntoft TF.Normalisation of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalisation, applied to bladder and coloncancer data sets.Cancer Res, 2004, 64:5245-5250 [25] Pont-Kingdon G, Lyon E.Direct molecular haplotyping by melting curve analysis of hybridization probes: beta2-adrenergic receptor hapotypes as an example.Nucleic AcidsRes, 2005, 33:89
[26] Janet Barletta.Applications of real-time immuno-polymerase chain reaction(rt-IPCR)for the rapid diagnoses of viral antigens and pathologic proteins.Molecular Aspects of Medicine, 2006, 27:224-253 [27] Glockner S, Lehmann U, Wilke N, et al.Detection of gene amplification in intraductal and infiltrating breast cancer by laser-assisted microdissection and quantitative real-time PCR.Pathobiology, 2000, 68(4-5):173-179 [28] Specht K, Richter T, Muller U, et al.Quantitative gene expression analysis in microdissected archival formalin-fixed and paraffin-embedded tumor tissue.Am J Pathol, 2001, 158(2):419-429 [29] Al-Taher A, Bashein A, Nolan T, et al.Global cDNA amplification combined with real-time RT-PCR:accurate quantification of multiple human potassium channel genes at the single cell level.Yeast, 2000, 17(3):201-210 [30] Rozzo SJ, Allard JD, Choubey D, et al.Evidence for an interferon-inducible gene, Ifi202, in the susceptibility to systemic lupus.Immunity, 2001, 15(3):435-443 [31] Rickman DS, Bobek MP, Misek DE, et al.Distinctive molecular profiles of high-grade and low-grade gliomas based on oligonucleotide microarray analysis.Cancer Res, 2001, 61(18):6885-6891 [32] Neil J, Gibson.The use of real-time PCR methods in DNA sequence ariation analysis.Clinica Chimica Acta, 2006, 363:32-47
第二篇：《分子生物学与基因工程》课程论文
植物基因工程研究进展
摘要：自1983年美国人首先成功地获得抗卡那霉素的烟草再生植株开始，人类就开始了植物基因工程的研究。至今已在逾200种植物中成功地获得了转基因植株,并有近1000例转基因植物获准进行田间试验,更有十余种转基因植物(如转基因棉花.大豆)已进入商业化种植.转基因产品已进入人们日常生活。植物基因工程的应用已进入蓬勃发展阶段。下面是我从植物基因工程改善生物质能利用的研究进展做一说明。
关键词：木质纤维素 细胞壁 水解酶
近几年来全世界对能源的需求量急剧增加加速了对有限的不可再生矿物质 能源的消耗资源的利用也增加了CO2及粉尘的排放,造成环境破坏和全球气候变 化[1]可再生的清洁的生物质能成为人们关注的热点。其中的燃料乙醇工业,近年来在世界范围内得到了广泛的发展,我国也大力支持发酵乙醇用作能源[2]。目前,绝大部分乙醇来源于玉米淀粉发酵生产。但是由于淀粉本身又作为食品和饲料,产量有限,成本较高,阻碍了乙醇工业的发展。于是,人们把注意力转移到谷物秸秆等廉价 的含有大量 的木质 纤维素 的生物质 材料上希望 能够被 充分利用 [3]。但由于木质纤维素本身难以分解,许多研究利用 基 因工程 方法 改善植物,使自生产生的多糖资源更利于降解,用于发酵产乙醇。1.木质纤维素发酵生产乙醇发展现状
在中国,大约每年会产生10t亿农林业废弃物这些资源用于造纸、纺织或者直接作为燃料这些占到很少一部分。绝大部分被废弃了木质纤维素是光合作用的基本产物 , 也是生物圈产生的最充足的可再 生生物资源被认为是地球上最丰富的生物高分子聚合[4]。
大部分的高等植物细胞壁由胶联多糖、糖蛋白和木质素组成双 子 叶植物 , 如拟南芥等,细胞壁多糖主要有三种:纤维素半、纤维素和果胶质,包埋在非 纤 维多糖基质(半纤维素和果胶)中的纤维素网络,与木质素和结构蛋白共同构成植物细胞壁的聚合液晶结构[5]天然状态下由于木质素的保护作用,阻碍了水解 纤维素酶与纤维素的接触并发挥作用,成为影响纤维素水解的重要因素 [3, 4]。YangB等人发酵降解实验证明,虽然半纤维素对纤维素。也有一定保护作用 , 但木质素的去除对于纤维素有效降解是最关键的[6]。一般对木质纤维素材料 的利用,首先要进行粉碎,然后预处理(酸碱处理等),最后 添 加 微 生物 来源 的纤维素复合水解酶类,使之与处理过的木质纤维充分接触,将其降解为单糖 , 从而用于乙醇发酵。现在虽然前期的粉碎和预处理工艺研究取得了很大进展但成本仍然较高，而且后期发酵分解处理。要添加来源于微生物的纤维素水解复合酶,价格仍十分昂贵[7]。这些因素导致目前用木质纤维素作为这些因素 导致 目前用木质纤维素作为原料发酵产乙醇,成本较高发展缓慢因此,现在对木质纤维素进行高效降解使用,仍然是个很大的难题。2.植物基因工程与植物木质纤维素利用
近年来随着生物技术的不断进步,人们开始尝试利用植物基因工程方法来 解决植物木质纤维素有效利用问题研究主要集中在改善植物细胞壁木质纤维素结构和含量比例等方面,使植物多糖资源利于降解使用，或者利用植物作为生物反应器,在植物内表达微生物来源的强活性纤维素降解酶,使植物自身表达高活性纤维素水解 酶类等研究。2.1 改善植物细胞壁的结构与组成
过去几十年的研究,改善木质素含量及细胞壁已成为可能。利用基 因工程方法,控制植物内木质素合成相关基因的表达,可以改变木质素结构和含量木质素对纤维素形成的保护作用是导致 纤维素资源利用 的主要障碍,降低木质素含量或改变其结构,将利于纤维素 的分解[8]。虽然植物体木质素的合成过程还不是十分清楚,但近几年的研究,已使大量降低木质素含量成为可能。
在玉米和苜蓿的研究中发现,木质素合成单体之一的芥子醇, 其前体的甲基化合成酶基因COMT(caffeate/5-hydroxyferulate O-methyltransferase),如果被抑制表达,芥子单体含量会明显减少,可导致木质素含量降低 [9, 10]但是在杨树中抑制这种酶的表达却不能够改善材质,木质素含量反而增加[11]。Li L等人在杨树中研究发现,通过反义表达4CL基因(4-coumarate-CoA ligase)时,木质素含量了减少了约40%,并且导致10%的纤维素含量的增加，如果正义表达控制木质素组成单体紫丁香基丙 烷(syringyl)和愈疮木基丙烷(guaiacyl)比率的CAld5H基因(Coniferaldehyde 5-hydroxylase),可导致紫丁香基丙烷的量明显增 高,但木质素含量没有变化[12]。当两基因同时转化时,木质素含量减少可达53%,紫丁香基丙烷含量进一步增加,而纤维素含量能够增加30%。Cano-Delgado A等人研究拟南芥CESA3突变体发现,纤维素合成酶受损时,导致了木质素大量合成[13]这表明在植物木质部细胞中可能存在一种调控机制,当木质素含量减少时,为了维持支撑作用,纤维素含量会相应增加。Chabannes M等人在烟草中研究发现,同时抑制CCR(Cinnamoyl CoA reductase)和 CAD(Cinnamyl alcohol dehydrogenase)的表达,可大量减少木质素含量,但非预期 的还引起了细胞壁多糖酚类物质及可溶性酚类物质含量的变化[14]等人在番茄中抑制表达木质素合成相关的CCR基因,导致木质素含量降低,同时与木质素形成具有共同前体的酚类复合物增加[15]。Boudet AM等人通过抑制杨树木质素合成酶基因CCR,可导致植物细胞壁纤维 素成分更容易被纤维素分解菌Clostridium产糖量达到原来的2倍[16]这表明,降低木质素等物质含量后,非常利于纤维资源的利用。Li Y等人研究发现,过氧化酶影响了木质化过程[17]。Blee KA等人在烟草中反义抑制过氧化酶FBP1(French bean cationic peroxidase)同系物表达,在不影响植物生长发育的情况下,使木质素含量降低了40%~50% [18]。通过基因工程方法,改变木质素结构与含量的方法改善植物细胞壁结构,利于作为能源植物,具有重要的研究价值。
2.2 植物体内表达木质纤维素水解酶
过去几十年的发展,植物已成功的作为重组蛋白表达的生物反应器,它相对于微生物和动物表达的优势是具有较低的成本已在多种植物里面进行了异源重组蛋白的表达研究(如疫苗和工业用酶等),蛋白表达量高且保持了很好的生物学活性[19]。近几年,人们开始在植物体内进行微生物来源的研究,希望这些植物作为生物反应器,大量表达并在细胞内积累纤维素酶。收获的植物,经过粉碎和预处理(酸碱处理等)后,在分解过程中能利用自身表达的酶,不添加加来源于微生物的酶,就可以将纤维素充分分解为单糖, 进一步用于生产乙醇,降低生产成本(Sticklen M,2006)[20]。考虑到细胞质表达对植物生长影响较大,一般采用定向胞外或细胞器积累表达（如定向质外体叶绿体溶酶体等）Ziegler MT等人在拟南芥中,定向质外体,积累表达了来源于Acidothermus cellulolyticus的耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶(Endo-1,4-β-glucanase),表达量约达到叶子总可溶性蛋白的26%,并且保持了很好的活性[21]，同样是在拟南芥中,Hyunjong B等人定向叶绿体和过氧化酶体,积累表达来源于Trichoderma reesei的木聚糖酶(Xylase),达到了总可溶性蛋白的4.6%,明显 高于细胞质表达和单一细胞器定向表达[22]在烟草中Dai Z等人定向叶绿体,积累表达了A.cellulolyticu 的耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶,达到总可溶性蛋白的1.35%[23]。Dai Z等人采用同样的酶,比较了定向不同细胞器积累表达的差异,发现定向质外体表达蛋 白量最高,且保持了较好的活性[24]。在其它的植物中,也进行了相关的研究, Xue GP等人在大麦的胚乳中,特异表达来源于Neocallimastix patriciarum 的内切-β-1,4-葡聚糖酶,约达到了总种子蛋白的1.5%[25]。Oraby H 等人在水稻中,定向质外体积累表达了A.cellulolyticu耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶,达到了叶子总可溶性蛋白的 4.9%。
目前的研究集中于将植物作为生物反应器,尽可能多的表达并积累纤维素酶,用于后期的处理。在发酵分解过程可以利用植物自身表达的异源纤维素水解酶,节省了额外添加酶的量。表达 的大都是内切-β-1,4-葡聚糖酶或木聚糖酶,为了预处理后还 能保持较好活性,多采用稳定性强的耐高温酶。由于纤维素有效降解需要复合水解酶,并且木质素对其具有很强的保护作用,这些植物不会发生自身降解。3.前景与展望
利用不断发展的植物基因工程技术,在能源植物研究方面已经取得了不错的研究进展。但是,目前要实现廉价充分的利用纤维资源,还有一定的困难。通过对植物细胞壁合成 代谢研究的不断深入,应该能够获得对自身生长发育不影响的低木质素植物细胞壁木质素结构及含量改善纤维素含量增加,利于降解发酵产乙醇。还希望最终能够获得一种能源植物,这种植物通过自身表达异源的高活性木质纤维水解复合酶,酶的表达受到诱导调控,收获前诱导表达,收获后送往生物能源发酵工厂。这期间,木质纤维素多糖在植物体内也可进行持续降解,在发酵工厂只需添加一些简单的辅助分解酶就可以彻底降解掉,使木质纤维资源产乙醇变得十分简单 参 考 文 献: 1.Dorian JP, Franssen HT, Simbeck DR.Energy Policy, 2006, 34 : 1984~1991.2.Yang B, Lu Y.J Chem Technol Biotechnol, 2007, 82 : 6~10.3.Himmel ME, et al.Science, 2007, 315 : 804~807.4.Ding SY, Himmel ME.J Agric Food Chem, 2006, 54(3): 597~606.5.Cosgrove DJ.Nat Rev Mol Cell Biol 2005 6 11 850~861.6.Yang B Wyman CE.Biotechnol Bioeng 2004 86 1 88~95.7.Kabel MA, et al.Biotechnol Bioeng, 2005, 93 : 56~63.8.Ragauskas AJ, et al.Science, 2006, 311 :484~489.9.Piquemal J et al.Plant Physiol 2002 130 4 1675~1685.10.Guo D et al.Transgenic Res 2001 10 5 457~464.11.Pilate G et al.Nat Biotechnol 2002 20 6 607~612.12.Li L et al.Proc Natl Acad Sci USA 2003 100 8 4939~4944.13.Cano Delgado A, et al.Plant J, 2003, 34(3): 351~362.14.Chabannes M et al.Plant J 2001 28 3 257~270.15.van der Rest B et al.J Exp Bot 2006 57 6 1399~1411.16.Boudet AM Kajita S Grima Pettenati J et al.Trends Plant Sci2003 8 12 576~581.17.Li Y et al.J Plant Res 2003 116 3 175~182.18.Blee KA, et al.Phytochemistry, 2003, 64(1): 163~176.19.Streatfield SJ.Plant Biotechnol J 2007 5 1 2~15.20.Sticklen M.Curr Opin Biotechnol 2006 17 3 315~319.21.Ziegler MT, Thomas SR, Danna KJ.Mol Breed, 2000, 6 : 37~46.22.Hyunjong B, Lee DS, Hwang I.J Exp Bot, 2006, 57 : 161~169.23.Dai Z, Hooker BS, Anderson DB, et al.Transgenic Res, 2000, 9(1):43~54.24.Dai Z, et al.Transgenic Res, 2005, 14(5): 627~643.25.Xue GP et al.Plant Cell Rep 2003 21 11 1088~1094.
第三篇：建筑与材料结课论文
建筑与材料结课论文
对于土木工程材料——水泥的认知与感悟
摘要：水泥是当代最主要的土木工程材料之一。它是土木工程中用途最广，用量最大的一种建筑材料。水泥具有多种优点，其技术与经济意义是其它建筑材料所无法比拟的。由于水泥种类繁多，技术性质复杂，影响因素众多，因此正确的了解水泥的品种，合理使用水泥，以及对其生产工艺的熟识和养护与禁忌的良好认知，才能充分发挥水泥材料的优点，将其应用于各种建筑。关键词：定义
分类
技术特性
生产工艺
影响因素
导语：水硬性胶凝材料是无机胶凝材料之一，其特点是加水拌合形成浆体后，能在空气和水中凝结硬化，保持并继续发展期强度。应用于土木工程中的水硬性胶凝材料是各种水泥。水泥呈灰色粉末状，当与其他材料和水充分拌合后，经过一系列的物理化学变化即凝结硬化呈坚硬的人造石材。水泥是土木工程中最重要的建筑材料之一。一
定义
粉状水硬性无机胶凝材料。加水搅拌成浆体后能在空气或水中硬化，用以将砂、石等散粒材料胶结成砂浆或混凝土。水泥的历史最早可追溯到古罗马人在建筑中使用的石灰与火山灰的混合物，这种混合物与现代的石灰火山灰水泥很相似。用它胶结碎石制成的混凝土，硬化后不但强度较高，而且还能抵抗淡水或含盐水的侵蚀。长期以来，它作为一种重要的胶凝材料，广泛应用于土木建筑、水利、国防等工程。二 分类
水泥按用途及性能分为：
（1）通用水泥: 一般土木建筑工程通常采用的水泥。通用水泥主要是指：硅酸盐水泥、普通硅酸盐水泥、矿渣硅酸盐水泥、火山灰质硅酸盐水泥、粉煤灰硅酸盐水泥和复合硅酸盐水泥。
（2）专用水泥：适应于专门用途的水泥。如：道路水泥，砌筑水泥，油井水泥等。
（3）特性水泥：某种性能比较突出的水泥。如：快硬硅酸盐水泥、抗硫酸盐硅酸盐水泥，低热微膨胀水泥，中热硅酸盐水泥，低热矿渣硅酸盐水泥等。
这些水泥中，硅酸盐水泥是硅酸盐系水泥的一个基本品种，其他种类的水泥都是在此基础上加入一定量的混合材料，或者适当改变水泥熟料的矿物成分而制成的。
水泥按其主要主要矿物成分分为：
（1）硅酸盐系水泥；
（2）铝酸盐系水泥；
（3）磷酸盐系水泥；
（4）氟铝酸盐水泥；
（5）硫铝酸盐水泥；（6）铁铝酸盐水泥；（7）无熟料水泥等
其中硅酸盐系水泥在工程中应用最为普遍。三
主要技术特性分为：
（1）快硬性：分为快硬和特快硬两类；
（2）水化热：分为中热和低热两类；
（3）抗硫酸盐性：分中抗硫酸盐腐蚀和高抗硫酸盐腐蚀两类；
（4）膨胀性：分为膨胀和自应力两类；
（5）耐高温性：铝酸盐水泥的耐高温性以水泥中氧化铝含量分级。四
生产工艺 生产方法
硅酸盐类水泥的生产工艺在水泥生产中具有代表性，是以石灰石和粘土为主要原料，经破碎、配料、磨细制成生料，然后喂入水泥窑中煅烧成熟料，再将熟料加适量石膏（有时还掺加混合材料或外加剂）磨细而成。
水泥生产随生料制备方法不同，可分为干法（包括半干法）与湿法（包括半湿法）两种。
①干法生产。将原料同时烘干并粉磨，或先烘干经粉磨成生料粉后喂入干法窑内煅烧成熟料的方法。但也有将生料粉加入适量水制成生料球，送入立波尔窑内煅烧成熟料的方法，称之为半干法，仍属干法生产之一种。
②湿法生产。将原料加水粉磨成生料浆后，喂入湿法窑煅烧成熟料的方法。也有将湿法制备的生料浆脱水后，制成生料块入窑煅烧成熟料的方法，称为半湿法，仍属湿法生产之一种。
干法生产的主要优点是热耗低（如带有预热器的干法窑熟料热耗为3140～3768焦/千克），缺点是生料成分不易均匀，车间扬尘大，电耗较高。湿法生产具有操作简单，生料成分容易控制，产品质量好，料浆输送方便，车间扬尘少等优点，缺点是热耗高（熟料热耗通常为5234～6490焦/千克）。
生产工序
水泥的生产，一般可分生料制备、熟料煅烧和水泥制成等三个工序，整个生产过程可概括为“两磨一烧”。
（1）生料磨制
分干法和湿法两种。干法一般采用闭路操作系统，即原料经磨机磨细后，进入选粉机分选，粗粉回流入磨再行粉磨的操作，并且多数采用物料在磨机内同时烘干并粉磨的工艺，所用设备有管磨、中卸磨及辊式磨等。
湿法通常采用管磨、棒球磨等一次通过磨机不再回流的开路系统，但也有采用带分级机或弧形筛的闭路系统的。
（2）煅烧
煅烧熟料的设备主要有立窑和回转窑两类，立窑适用于生产规模较小的工厂，大、中型厂宜采用回转窑。
①立窑：
②回转窑：
a.干法窑
b.湿法窑
（3）粉磨
水泥熟料的细磨通常采用圈流粉磨工艺（即闭路操作系统）。为了防止生产中的粉尘飞扬，水泥厂均装有收尘设备。电收尘器、袋式收尘器和旋风收尘器等是水泥厂常用的收尘设备。
五 影响水泥凝结硬化的因素
影响水泥凝结硬化的因素，有水泥熟料的矿物组成，细度，用水量，还有养护时间，温度和湿度。
课本第32,33页
六
使用八忌（1）忌受潮结硬
受潮结硬的水泥会降低甚至丧失原有强度，所以规范规定，出厂超过3个月的水泥应复查试验，按试验结果使用。对已受潮成团或结硬的水泥，须过筛后使用，筛出的团块搓细或碾细后一般用于次要工程的砌筑砂浆或抹灰砂浆。对一触或一捏即粉的水泥团块，可适当降低强度等级使用。
（2）忌曝晒速干
混凝土或抹灰如操作后便遭曝晒，随着水分的迅速蒸发，其强度会有所降低，甚至完全丧失。因此，施工前必须严格清扫并充分湿润基层；施工后应严加覆盖，并按规范规定浇水养护。
（3）忌负温受冻
混凝土或砂浆拌成后，如果受冻，其水泥不能进行水化，兼之水分结冰膨胀，则混凝土或砂浆就会遭到由表及里逐渐加深的粉酥破坏，因此应严格遵照《建筑工程冬期施工规程》（JGJ104—97）进行施工。
（4）忌高温酷热 凝固后的砂浆层或混凝土构件，如经常处于高温酷热条件下，会有强度损失，这是由于高温条件下，水泥石中的氢氧化钙会分解；另外，某些骨料在高温条件下也会分解或体积膨胀。
对于长期处于较高温度的场合，可以使用耐火砖对普通砂浆或混凝土进行隔离防护。遇到更高的温度，应采用特制的耐热混凝土浇筑，也可在混凝土中掺入一定数量的磨细耐热材料。
（5）忌基层脏软
水泥能与坚硬、洁净的基层牢固地粘结或握裹在一起，但其粘结握裹强度与基层面部的光洁程度有关。在光滑的基层上施工，必须预先凿毛砸麻刷净，方能使水泥与基层牢固粘结。
基层上的尘垢、油腻、酸碱等物质，都会起隔离作用，必须认真清除洗净，之后先刷一道素水泥浆，再抹砂浆或浇筑混凝土。
水泥在凝固过程中要产生收缩，且在干湿、冷热变化过程中，它与松散、软弱基层的体积变化极不适应，必然发生空鼓或出现裂缝，从而难以牢固粘结。因此，木材、炉渣垫层和灰土垫层等都不能与砂浆或混凝土牢固粘结。
（6）忌骨料不纯
作为混凝土或水泥砂浆骨料的砂石，如果有尘土、粘土或其他有机杂质，都会影响水泥与砂、石之间的粘结握裹强度，因而最终会降低抗压强度。所以，如果杂质含量超过标准规定，必须经过清洗后方可使用。
（7）忌水多灰稠
人们常常忽视用水量对混凝土强度的影响，施工中为便于浇捣，有时不认真执行配合比，而把混凝土拌得很稀。由于水化所需要的水分仅为水泥重量的20%左右，多余的水分蒸发后便会在混凝土中留下很多孔隙，这些孔隙会使混凝土强度降低。因此在保障浇筑密实的前提下，应最大限度地减少拌合用水。
许多人认为抹灰所用的水泥，其用量越多抹灰层就越坚固。其实，水泥用量越多，砂浆越稠，抹灰层体积的收缩量就越大，从而产生的裂缝就越多。一般情况下，抹灰时应先用1：（3—5）的粗砂浆抹找平层，再用1：（1.5—2.5）的水泥砂浆抹很薄的面层，切忌使用过多的水泥。
（8）忌受酸腐蚀
酸性物质与水泥中的氢氧化钙会发生中和反应，生成物体积松散、膨胀，遇水后极易水解粉化。致使混凝土或抹灰层逐渐被腐蚀解体，所以水泥忌受酸腐蚀。
在接触酸性物质的场合或容器中，应使用耐酸砂浆和耐酸混凝土。矿渣水泥、火山灰水泥和粉煤灰水泥均有较好耐酸性能，应优先选用这三种水泥配制耐酸砂浆和混凝土。严格要求耐酸腐蚀的工程不允许使用普通水泥。
七 使用注意
1、要注意砂浆的合理配比。例如，要按照使用的部位例如抹墙，贴地砖，贴墙砖等选择合适的砂浆比例，每次搅拌好的砂浆以在两个小时使用完毕为宜。
2、选用建材市场上专用的砂浆用砂，尤其要控制沙子质量的含泥，泥含量高将降低粘结程度。
3、瓷砖使用前应充分浸泡后（两小时以上）阴干，避免砂浆因失水降低强度；地砖宜用干铺，墙砖宜湿铺。
4、砂浆搅拌要均匀，拌制砂浆后建议在2小时30分钟内使用。八 对未来水泥的展望
未来10年，国际水泥工业的发展趋势是以节能，降耗，环保，改善水泥质 量和提高劳动生产率为中心，实现清洁生产和高效率集约化生产，走可持续发展的道路。研究的重点主要是围绕水泥工业节能降耗，减少有害气体（CO,SO 等）的排放。
结语
在当今社会建设方面，水泥已经广泛应用于各种行业的建筑，它已成为一种不可缺少的建筑材料。我们应充分发挥其优点，将其合理的使用在建筑当中。最大限度的延长建筑的使用期限。
第四篇：基因工程论文（范文模版）
浅析基因工程技术的应用现状
动物医学专业
任课教师
指导教师姓名
摘要: 基因工程作为一门理论性与实践性较强的学科,其方法与技术已经渗透到现代生命科学的各个分支领域,成为生命科学的一门核心技术。基因工程包含许多独特的实验方法和技术,不仅内容丰富,涉及面广,实用性也强。基因工程是通过DNA 重组技术, 获得具有特殊生物遗传性状和功能的遗传工具生物体, 基因工程技术广泛应用于农业、医学、食品工业等。本文就基因工程的应用现状综合阐述。关键词 : 基因工程;应用现状
0.前言
基因工程技术是一项极为复杂的高新生物技术, 它利用现代遗传学与分子生物学的理论和方法, 按照人类所需, 用DNA 重组技术对生物基因组的结构和组成进行人为修饰或改造, 从而改变生物的结构和功能, 使之有效表达出人类所需要的蛋白质或人类有益的生物性状[1]。基因工程从诞生至今, 仅有30 年的历史, 然而, 无论是在基础理论研究领域, 还是在生产实际应用方面, 都已取得了惊人的成绩。首先,基因工程给生命科学自身的研究带来了深刻的变化。目前科学家已完成了多种细胞器的基因组全序列测定工作。其次, 基因工程具有广泛的应用价值, 能为工农业生产、医药卫生、环境保护开辟新途径。
1.基因工程
1.1 概念
基因工程(又称DNA 重组技术、基因重组技术), 是20 世纪70 年代初兴起的技术科学, 是用人工的方法将目的基因与载体进行DNA重组, 将DNA 重组体送入受体细胞, 使它在受体细胞内复制、转录、翻译, 获得目的基因的表达产物。这种跨越天然物种屏障, 把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力, 是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。1.2 基因工程研究内容
(1)从复杂的生物有机体基因组中, 经过酶切消化或PCR 扩增等步骤, 分离出
带有目的基因的DNA 片段。
(2)在体外, 将带有目的基因的外源DNA 片段连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上, 形成重组DNA分子。
(3)重组DNA 分子转移到适当的受体细胞, 并与之一起增殖。
(4)从大量的细胞繁殖群体中, 筛选出获得了重组DNA 分子的受体细胞克隆。(5)从这些筛选出来受体细胞克隆, 提取出已经得到扩增的目的基因, 供进一步分析研究使用。
(6)将目的基因克隆到表达载体上, 导入寄主细胞, 使之在新的遗传背景下实现功能表达, 产生出人类所需要的物质。
2.基因工程的广泛应用
2.1 在农业上的应用
2.1.1 抗除草剂的植物基因工程
资料表明, 每年杂草造成的经济损失占农作物总产值的10%-20%左右尽管除草剂的使用, 对大规模机械化耕作, 减少劳力开支和提高量有极为重要的作用, 但一般除草剂的选择性较差, 即除了杀草以外, 还会将作物杀死。现在利用生物技术, 将能抵抗除草剂的基因转移到植物中, 获得抗除草剂的植物, 如美国的孟山都公司将除草剂草甘磷的靶酶(EPSPS)的cDNA 克隆转入油菜[2] , 目前, 已获得的抗除草剂作物有大豆、棉花、玉米、水稻和甜菜等20 多种。2.1.2 抗虫的植物基因工程
生物防治害虫的工作已经开展多年, 主要是利用苏云金杆菌中的毒蛋白(结晶蛋白)对害虫有毒害作用, 使用这些杆菌来控制害虫。现在, 人们可以通过克隆这些毒蛋白的基因(Bt 基因)并把这些基因转移到植物细胞中, 从而获得能抗虫的转基因植物。目前, Bt 基因已被转入烟草、番茄、马铃薯、水稻、玉米及棉花等多种植物中。1996 年转Bt 基因棉花在美国种植66 万hm2 经中国农科院棉花所引进在华北试种两年, 在多点表现突出, 在完全不喷杀虫剂的情况下, 单产仍然高于喷撒2-3 次杀虫剂的中国推广棉花[3] , 显示出了控制棉铃虫的极好前景。2.1.3 动物转基因育种
动物基因工程研究主要集中在改良家畜、家禽的经济性状和通过转基因动物进行药物或蛋白质的生产等方面, 目前已取得了显著的成就, 先后培育出转基因猪、羊、牛和鱼等, 另一种转基因猪是带有人体基因的猪, 这种转基因猪客望能解决人体移植动物器官的遗体排斥问题。随着动物基因工程技术的逐渐成熟和转人体血红蛋白的基因猪、转人体血清蛋白的基因山羊等的问世, 不仅能生产出大量人类所需的血红蛋白、白蛋白等药物而且为动物育种开辟了一条全新的途径。
2.2 在医学上的应用 2.2.1 基因工程药物
利用基因工程技术开发新型治疗药物是当前最活跃和发展最快的领域。自1982 年世界第一个基因工程药物---重组胰岛素投放市场以来, 基因工程药物就成为制药行业的一支奇兵, 每年平均有3-4 个新药或疫苗问世, 开发成功的约50 个药品, 诸如人胰岛素、忍尿激酶、人生长激素、干扰素、激活剂、乙肝疫苗等广泛应用于治疗癌症、肝炎、发育不良、糖尿病和一些遗传病上, 在很多领域特别是疑难病症上, 起
到了传统化学药物难以达到的作用[4, 5, 6]。为治愈癌症正在研制的用单克隆抗体制成的“生物导弹”, 就是按照人类的设计, 把“生物导弹”发射出去, 精确的命中癌细胞, 并炸死癌细胞, 而不伤害健康的细胞, 比如专门用于肿瘤的“肿瘤基因导弹”等。可见, 生物工程药物将成为21世纪药业的支柱。而脱氧核糖核酸或者基因疫苗的问世, 变革了机体的免疫方式。如今, 人们翘首关注困扰人类的艾滋病病毒疫苗的早日问世。
尽管目前诱变育种技术仍是改良微生物工业生产菌种的主要手段,但是基因工程技术在改良工业生产菌种方面已有成功的报道。最常见的是将控制药物合成关键步骤的酶基因克隆,通过适当的载体转移到原生产菌中,以使控制限速步骤的酶水平,从而提高产量。Malmberg等[7]构建了一种带有编码赖氨酸ε-氨基转移酶基因(lysine-ε-aminotranster-ase,LAT)这种控制Streptomyces clavuligerus生物合成头霉素C的限速步骤的关键酶的基因(lat)的高拷贝质粒,并转入这种头霉素产生菌,使LAT提高活力提高了4倍,在2 L发酵罐中产生头霉素的能力是原来的2倍,重组菌胞外LAT产物α-氨基己二酸的积累量也比原受体
菌高。伊维菌素(ivermectins)是一个市场很大的抗虫
抗生素,其前体阿弗米丁(avermectins)的产生菌种的发酵液中有8个以上的组分,其中只有B1a组分才是制备伊维菌素的原料。Ikeda等[8]经过近十年的努力,已将阿弗米丁的生物合成基因簇全部搞清,并经过诱变与DNA重组,获得了仅产阿弗米丁B2a单一组分和B1a、B2a组份的重组工程菌,这不仅大大提高了阿弗米丁有效组分的发酵效价,且给提取、精制、半合成等后处理工序带来了很大的便利。可以预见,随着对各种工业生产的微生物药物生物合成途径的深入了解以及基因重组技术的不断进展,应用基因工程方法定向构建高产菌株的成功实例将越来越多。在抗生素发酵过程中供氧往往是一个限制因素,充足的氧气供给是药物工业发酵稳定和提高产量,降低成本的关键。传统的解决方法如增加通气量等对设备要求高,能量消耗大。20世70年代末在专性好氧菌透明颤(Vitreoscilla)中发现了血红蛋白(VHb),它能促进氧气扩散到细胞末端氧化酶上。于是人们想到了将其基因Vgb克隆到其它微生物中,以促进微生物在低氧条件下生长。
1988年Khosla等[9]从Vitreoscilla中分离出Vgb基因并将之转入大肠杆菌(E·coli),提高了大肠杆菌在溶氧量低于5%时对氧的利用率。目前已用克隆表达VHb的方法提高了放线紫红素、头孢霉素C、红霉素等产生菌及青霉素酰化酶基因工程菌的产量[10]。血红蛋白基因工程的研究和应用,必将对抗生素工业和其它重组药物发酵工业的节能等带来美好的前景。作为半合成头孢菌素类抗生素重要原料的7-氨基头孢烷酸（7-ACA),目前国内外仍以化学裂解头孢菌素C的工艺路线为主。国内外已报道可用经由GL-7-ACA的二步法(化学/酶法或二步酶法)来生产7-ACA,与化学裂解法相比不仅收率提高,且能大大减少环境污染,简化生产工艺。但二步法中关键的GL-7-ACA酰化酶在假单胞菌中表达量低而且分离纯化困难,限制了这种方法的应用。通过将GL-7-ACA酰化酶基因转入大肠杆菌中表达恰好可以解决这一问题[11]。最近又报道可将编码2个酶的基因直接转入头孢菌素C的生产菌种中,使其在发酵时直接产生7-ACA。调节基因在药物的生物合成中也起着重要作用,增加调节基因的基因量能够大幅提高药物产量。Hopwood等将放线紫红素生物合成的一个调节基因actⅡ导入原产生菌,尽管基因的拷贝数仅增加了2倍,放线紫红素的产量却增加了30~40倍。某些抗生素生产菌的产量不高,是由于其自
身对该抗生素的抗性不高。因此,利用高拷贝质粒的基因量效应,增加菌种对自身产生的抗生素的抗性,可能增加抗生素的产量。例如,将氨基糖苷-6-乙酰转移酶基因导入卡那霉素和新霉素产生菌,由于提高了对氨糖类抗生素的抗性,产量提高了2~6倍 2.2.2 基因治疗
基因治疗是指由于某种基因缺陷引起的遗传病通过转基因技术而得到纠正。临床实践已经表明: 基因治病已经变革了整个医学的预防和治疗领域。比如白痴病, 用健康的基因更换或者矫正患者的有缺损的基因, 就有可能根治这种疾病。现在已知的人类遗传病约有4000种, 包括单基因缺陷和多基因的综合症。运用基因工程技术或基因打靶的手段, 将病毒的基因杀灭, 插入矫正基因, 得以治疗、校正和预防遗传疾病的目的。目前, 基因治疗已扩大到肿瘤、心血管系统疾病、神经系统疾病等的治疗[12]。人类也已成功实现了肾、心、肝、胰、肺等器官的移植, 也有双器官和多器官的联合移植。
基因治疗有两种途径: 一是体细胞的基因治疗, 一是生殖细胞的基因治疗。由于生殖细胞的基因治疗操作技术异常复杂, 又涉及伦理缓行之理充足, 故尚无人涉足[13]。基因工程是20 世纪生命科学中最伟大的成绩, 开辟了生命科学的新纪元。经过几十年的发展, 基因工程技术已成为一个巨大的朝阳产业, 它可以超越动物、植物、微生物之间的界限, 创造出新的生物类型。基因工程不仅在医学上应用广泛, 而且也广泛应用在工业、农业、冶金、环保、资源、能源、畜牧渔业等领域, 为人类的丰衣足食和健康长寿提供了持续的实用价值很高的产品, 发展前景极为广阔。
参考文献：
[1] 陈渝军, 林晶.基因工程技术在医药卫生领域的应用及发展.药品评价,2005, 2(2): 144-145.[2] 童克中.基因及其表达.北京: 科学出版社, 2001.[3] 李尉民, 乐宁, 夏红民.转基因生物及其产品的风险与管理.生物技术通报.2000(4)41-44.[4] 朱宝泉.基因工程技术在医学工业中的应用及进展[ J].中国医药工业志.1997.28(2): 56-58.[5] 方鹏.基因工程应用简述[ J].辽宁师专学报.2004.6(2): 29-30.[6] 周黎, 柯传奎.基因工程药物研究现状与对策[ J].生命科学仪器2004.1: 22.[7] Malmberg LH, Hu WS, Sherman DH·Journal of Bacteriology,1993, 175(11): 6916~6924· [8] Haruo Ikeda, SatoshiOmura·Journal ofAntibiotics, 1995, 48(7):549~562· [9] Chaitan Khosla, JamesEB·Nature, 1988, 331: 633~635·
[10] 郭宏秋,杨胜利·微生物学通报, 1996, 23(4): 227~230· [11] 周煜,刘涤,胡之璧·药物生物技术, 2000, 7(4): 251~253·
[12] 路正兵, 夏颖.基因工程在疾病防治及药物研制上的应用[ J].安徽预防医学杂志.2000.6(5): 398-400.[13] 王俊杰21 世纪基因工程在肿瘤防治中的应用[ J] 2000.6(6):62-67.分子生物学
—谈基因工程技术如何应用于植物
摘要：通过基因工程改良品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。尽管科学家们对转基因植物的争论仍在继续，但可以肯定的是，转基因植物作为一项新兴的生物技术的产物，在解决日益膨胀的地球人吃饭问题和在解决长期困惑人类发展的资源短缺、环境恶化、经济衰退三大难题中起着越来越重要的作用。本文综述了基因工程技术在植物中的应用，就转基因植物的技术、发展、安全性和发展前景作了探讨。
关键词：基因工程技术；转基因植物；安全性；发展前景
所谓转基因植物是指利用基因工程技术，在离体条件下对不同生物的DNA进行加工，并按照人们的意愿和适当的载体重新组合，再将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞内表达的植物。自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速，成功的转基因植物已达60多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例。
1植物的转基因技术
由于植物的体细胞具有全能性，即单个的细胞经过合适培养后可以生成完整的植株。将分离能够编码所需产物的DNA片段克隆到适当的载体DNA中形成重组DNA，利用细菌繁殖扩增重组DNA并将重组DNA中的目的基因导入所需的培育的植物细胞中，筛选出所需要的细胞，通过细胞的全能性将转基因植株大规
模种植。
其中外源基因导入植物细胞的方法可分为DNA直接转化和以载体为媒介的基因转化。基因的直接转移是通过物理化学法将外源基因转入受体植物细胞的技术。常用的方法有化学刺激法、脂质体法、显微注射法和基因枪法等。其原理是利用物理化学方法暂时改变膜通透性，使DNA进入细胞，并最终整合到植物基因组中。
以载体为媒介的基因转化即使通过农杆菌或植物病毒介导感染受体植物将外源基因转入植物细胞的技术。目前，载体法主要包括土壤农杆菌Ti质粒、Ri质粒及植物DNA病毒等介导的遗传转化法。
2转基因植物的筛选与检测
通过转基因的方法将目的基因转入目的植物的细胞后，转化细胞与非转化细胞相比都只占少数，两者存在竞争，而转化细胞的竞争力通常比非转化细胞弱，因此必须对转化细胞进行筛选和检测。
在构建重组DNA时，人们已经引入了标记基因以对转化子选择和鉴定。报告基因由于其表达产物易于检测，已广泛用于转基因植物中。根据报告基因编码特点，大致分为两类：抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因或发光基因。根据检测的不同阶段区分，有DNA检测法、RNA检测法及蛋白质检测法。DNA检测法只能检测到外源基因是否已经整合到植物基因组中，而RNA检测法得到的结果可判定外源基因是否转录，蛋白质检测法则可检测出外源基因是否翻译。
3改进转基因的技术
随着植物转基因技术的创立和发展，许多具有重要经济价值的农作物获得了转基因植株，植物转基因技术成为植物育种的一个重要手段，但仍有许多问题阻碍了转基因技术在生产上的广泛的应用。将外源DNA导入植物细胞后，只有外源DNA在宿主细胞及其子代细胞中稳定整合和有效的表达，才能培育出具有新的遗传性状的转基因植物。大量研究表明外源基因在转基因植物中有的能正常表达，有的表达量很低，甚至不表达，而且在不同的植株个体之间也存在着明显差异。所以提高转基因的表达，减少转基因的失活是转基因技术的一个重要内容。提高外源基因表达水平的措施有: 3.1农杆菌介导的遗传转化方法由于其产生的拷贝数相对较少，可以在一定程度上避免这个问题。
3.2使用信号肽，每种植物蛋白质的作用空间位置都是不同的，蛋白质分子的定向运输需要特殊多肽信号的引导作用。3.3选择强启动子和诱导型启动子
3.4使用强终止子 常用的终止子时CaMV35S终止子和根瘤土壤杆菌T-DNA的胭脂氨基酸合成酶基因的nos终止子。
3.5消除甲基化的影响 在载体上加上去甲基化功能的序列以防止甲基化。3.6使用植物偏爱的密码子 3.7使用MAR序列 3.8使用增强子
3.9对外源基因进行修饰和改造 3.10以叶绿体作为转化受体 3.11使用一些病毒编码蛋白
3.12在有性生殖后代中筛选单拷贝植株
4基因工程在农作物上的应用
4.1抗虫转基因作物
最早获得的转Bt（苏云金杆菌）毒素基因植物是烟草和番茄，随后Bt毒素基因相继被转化到许多其他农作物中，如棉花、水稻、玉米等，获得了一大批具良好抗虫性的转基因植物品种。4.2抗病毒作物
植物病毒感染时一个严重的问题，它可导致农作物生长缓慢、产量降低和质量减退。转基因植物的成功使作物抗病毒成为可能并加速了作物抗病育种的研究进程。自1986年Powel-Abel首次将烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白（Cp）基因导入烟草，培育出抗TMV植株以来，已经将许多 病毒成功的构建了多种抗病毒植株，近几年的研究结果表明病毒外壳蛋白在系统杂交保护中起着重要的作用，插入一段已克隆的CP基因可以延缓病毒的发展和阻止病毒在转基因植株中进一步传播。
4.3抗细菌和真菌作物
细菌和真菌病在全部植物病害中造成的损失最大，很多科学家都在尝试从植物的生物体内寻找抗病原菌的蛋白及其基因，并将其用于植物基因工程。自1980年，瑞典科学家首次从美国惜古比天蚕种成功分离了3种诱导型的杀菌肽进行了深入的研究。它们对很多种植物病原菌有较强的杀伤作用。现在的实验结果表明，杀菌肽作用于细胞的细胞膜，破坏膜的完整性，造成离子通道，最终导致细胞内含物泄露。目前，杀菌肽基因工程已经在烟草、马铃薯等植物上有了初步报道。
4.4抗除草剂转基因作物
人类自有农业起就一直跟杂草作斗争，它是农业生产中的大敌，但由于它具有较强的生态适应性和抗逆性，所以给杂草的防治带来了困难。在大量使用化学除草剂的同时往往会对作物造成一定的伤害。为此人们在研究抗除草剂基因，将该基因转入植物，在喷施除草剂杀死杂草时，不伤害作物。20世纪80年代中期，抗除草剂基因被转入了作物体内，从而获得了抗除草剂的转基因大豆、棉花、玉米、油菜、小麦等。
4.5抗非生物胁迫作物
干旱时困扰农业生产的重要因素之一，它给农业生产带来巨大的损失，这种损失甚至是毁灭性的。CMO基因是合成乙酰-甜菜碱第一步反应关键酶的基因，具有很强的抗旱性。Rathinasabathi等奖烟草中的CMO基因导入水稻中，获得抗旱性较强的转基因水稻。可以相信在未来培育出的耐旱的新作物品种应该是转入多种共同作用的外源基因。
5转基因植物的安全性
..5．1转基因植物的优缺点 关于转基因植物及其安全性问题，是近年来的热 门话题，但目前国际上没有统一说法，争论不一。其主要优点：①增加食物供应，解决粮食短缺；②减少农药使用，避免环境污染；③降低生产成本，降低食物售价；④增加食物营养，提高附加价值；⑤增加食物种类，提升食物品质；⑥提高生产效率，带动相关产业发展。其主要缺点：①可能对蝴蝶等昆虫造成伤害； ②可能影响周边植物的生长；③可能使昆虫或病菌在演化中增加抵抗力或产生新的物种，因此有可能会伤害作物。..5．2转基因食品的安全性和可接受性
随着转基因技术的发展，转基因食品的安全性越来越受到人们的关注。转基因食品与传统食品相比，区别在于：首先它含有利用转基因技术导人的外源基因；其次可能存在外源基因在受体内的表达产物。由于这两种成分的不确定性以及由
此引起的次级效应，对人类健康可能有潜在的危害。目前人t fx转基因食品生物的担忧基本上可以归纳为3类：(1)转基因食品里加入的新基因无意中对消费者造成的健康危害；(2)转基因作物中的新基因对食物链其他环节无意中造成的不良后果；(3)人为强化转基因作物的生存竞争性，对自然界生物多样性的影响。其中人们最为担心的是转基因食品对人体健康是否安全，转基因食品与常规食品比较有无不安全的成分。这就需要对其主要营养成分、微量营养成分、抗营养因子的变化、有无毒性物质、有无过敏性蛋白以及转入基因的稳定性和插入突变进行检测。另外是人们对..“基因逃逸”的担心。所谓..“基因逃逸”，就是指微生物之间可以通过转导、转化、接合进行基因转移。人们主要是担心转基因作物及基因食品的有害基因是否会逃逸到人体或环境中，加快抗药性问题。如野生植物种通过受粉可能会完成抗除草剂的基因改良，会变成..“超级杂草”，由此形成的具有非自然抗逆性的植物对那些以其为生的动物们来说，可能会导致生物链的断裂。
6转基因植物的发展前景
转基因植物在人类发展史上，是人类对自然的认识和改造的结果，必将对人类的生存带来重大影响。随着人们对遗传本质认识的深化和生物技术水平的不断提高，大量的转基因植物不断涌现。通过转基因技术来改良作物的品质是一个不可阻挡的趋势，因为现在有许多问题是无法通过常规育种来解决的，特别是耐旱、耐贫瘠等作物品种的培育。例如非洲的沙漠地区，如果按照现在的育种手段，它的粮食产量根本不可能满足基本生活保证，人们现在 寄希望于通过转基因技术生产一些比较耐旱、耐贫瘠的作物，以解决因为土地可耕面积的减少而给人类带来的压力。另外，转基因技术可以改良作物的营养成分，现在非常知名的一个例子就是瑞士联邦技术研究所成功开发的金色大米，它是通过将胡萝卜素合成途径的关键基因转到水稻中去，生产出的大米是金黄色的，这种水稻含有VA的合成原料，在解决吃饭问题的同时有助于治疗因缺乏VA而导致的眼睛失明等疾病，这对于发展中国家非常重要。因此转基因技术具有广阔的发展前景。但是，在大力发展转基因食品的同时，应建立完善的转基因产品评价和监控体系。1 993年，世界经济合作与开发组织发表了..“现代生物技术食品的安全评价——概念和原则”，提出了..“质量等同性概念”，其含义是..“当某个由转基因技术生产的新食品的各项主要特征(分子学特征、遗传形状、主要营养成分等)与现有食品大致相同，则认为该新食品的安全性也与现有食品大体等同。”我国政府也于1 993年、1 996年和2 001年分别颁布了有关条例和规定，要求对转基因食品的试验、生产、应用等实行生产许可证和经营许可证制度，同时对违规试验、生产、应用、进出口转基因食品的机构和人员，规定了严厉的处罚措施。但如何维护消费者的知情权，对转基因食品实行标志制，如何加强对进口转基因食品的检验监管，保证我国的食品卫生安全等尚需进一步完善，加强研究。
综上所述，基因工程技术作为一项新兴的生物技术，其发展趋势不可阻挡。但科学技术是把双刃剑的理论同样适合转基因植物。为此，我们应该适当借鉴国外经验，建立一套既符合中国国情，又与国际接轨，且科学合理的基因安全评价和监控体系，为日后我国转基因植物走向世界奠定基础。
参考文献：
（1）李立家
肖庚富
基因工程
科学出版社 2010.8
（2）李书国，陈辉，庄玉亭．基因工程在食品工业中的应用．粮油与油脂，2001.2（3）夏焕章
熊宗贵 生物技术制药
高等教育出版社 2010.3（4）谈家桢．基因工程．北京：农业出版社，1979．..基因工程抗体研究进展及其临床应用
摘要：基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体，近年来随着生物工程技术的发展，许多基因工程抗体陆续问世，本文详细介绍了基因工程抗体的研究进展，概述了基因工程抗体在临床方面的明显优势和应用潜力。关键词：基因工程抗体；研究进展；临床引用
Advances in Genetic Engineering Research and Clinical
Application of Antibody
Student majoring in Professional Veterinary Medicine Name DongChuanJun
Tutor Name MinLingJiang
Abstract:Genetic engineering antibody is the third generation antibody after polyclonal antibody and monoclonal antibody.In recent years,with the development of bio-engineering techniques,many genetically engineered antibodies have been presented to the public,and this article elaborates on research progress of the genetic engineering antibody,and its obvious advantages and potentials in clinical application.Key words: Genetically engineered antibodies;Research;Clinical application.转基因技术迅速发展，其应用和发展的领域日益夸大。但转基因技术的弊端日益凸现，引起众多关注的目光。就转基因技术本身而言，社会各界对它的态度各有异同。不同的国家不同的民族和不同的个体对转基因技术的态度大相径庭。如何看待转基因技术？如何去应用和发展转基因技术？这些都是我们亟待解决的问题。基因工程抗体介绍
1.1 基因工程简介
基因工程抗体是借助DNA重组和蛋白质工程技术，在基因水平对免疫球蛋白分子进行切割、拼接、修饰和重新组装的一种新型抗体。所制备的抗体去除或减少了可引起副作用的无关结构，但保留天然抗体的特异性和主要生物学活性，并可赋予抗体分子以新的生物学活性的总称【1】。
由于目前制备的抗体均为鼠源性临床应用时，对人是异种抗原，重复注射可使人产生抗鼠抗体，从而减弱或失去疗效，并增加了超敏反应的发生，因此，在 80 年代早期，人们开始利用基因工程制备抗体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能[2]。目前多采用人抗体的部分氨基酸序列代替某些鼠源性抗体的序列，经修饰制备基因工程抗体，称为第三代抗体[3]。1.2 基因工程抗体种类
基因工程抗体主要包括嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体等。
1.2.1 嵌合抗体
嵌合抗体（chimeric atibody）是最早制备成功的基因工程抗体。它是由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子【4】。因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。
1.2.2 人源性抗体
是将人抗体的CDR代之以鼠源性单克隆抗体的CDR，由此形成的抗体，鼠源性只占极少，称为人源化抗体。
1.2.3 完全人源化抗体
采用基因敲除术将小鼠Ig基因敲除，代之以人Ig基因，然后用Ag免疫小鼠，再经杂交瘤技术即可产生大量完全人源化抗体。
1.2.4 单链抗体
是将Ig的H链和L链的V区基因相连，转染大肠杆菌表达的抗体分子，又称单链FV（single chain fragment of variable region,sFv）。SFv穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。
1.2.5 双特异性抗体
将识别效应细胞的抗体和识别靶细胞的抗体联结在一起，制成双功能性抗体，称为双特异性抗体。如由识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞（CTL细胞、NK细胞、LAK细胞）表面分子的抗体（CD3抗体或CD16抗体）制成的双特异性抗体，有利于免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用。基因工程抗体的研究进展
2.1抗体工程的发展
最近，美FD强调：目前在临床试验中基因工程抗体约占生物制剂的30%。重组抗体的体积越来越小，或被重新构建成多价分子，或与其它分子相融合，如放射性核素、毒素、酶、脂质体和病毒的药剂设计成为可能。
【5】
。重组技术的出现使筛选、人源化、抗体的生产得到革新，并取代杂交瘤技术，从而使以抗体为基础
图1：抗体的发展
2.2目前基因工程抗体制备的主要方法 2.2.1人鼠嵌合抗体
主要是利用基因重组技术，把鼠抗体的重轻链可变区部分与人抗体重轻链恒定区的进行重组，减少鼠源结构，增加人源结构，而保持抗体与原抗原的特异性结合【6】。
1.首先把小鼠编码Ig重轻链的基因剔除。2.制备表达人的Ig重轻链的转基因小鼠。
3.上二种小鼠回交，获得只表达人Ig重轻链的基因的小鼠。当用抗原免疫后，小鼠可产生完全人源抗体。2.2.2 噬菌体抗体库技术
1.人的Ig重轻链可变区基因片段展示在噬菌体表面,组成抗体库。2.过噬菌体把抗体的表型和基因型相偶联，易进行分子克隆和基因操作。3.抗体库的来源影响筛选结果（免疫和正常人）。4.高通量筛选与抗原结合的抗体，但亲和力低。2.2.3 用人的骨髓瘤细胞直接制备全人抗体
由于骨髓瘤细胞稳定性高和融合率高，所以要建立好的人骨髓瘤细胞。2.2.4 B细胞永生化技术
用EB病毒将人淋巴细胞永生化可产生分泌抗体的B细胞克隆【7】。这一技术较为成熟，但是存在抗体分泌不稳定的缺点，限制了其应用。或直接分离分泌抗体的B细胞,用PCR获得重轻连,构建全人抗体。2.3抗体药物发展现状
1.FDA已批准上市的抗体药物。
2.SFDA(中国)已批准上市及临床研究的的抗体药物。2.4工程抗体的未来发展与展望 2.4.1单克隆抗体的市场需求
图2：单抗体市场的预测与分析 3.基因工程抗体药物的应用
随着生物工程技术的发展，许多基因工程抗体 陆续问世，并在医学领域的许多方面都具应用潜力，如病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病、同种异体移植物注射、哮喘、中风和青光眼治疗，尤其在诊断和治疗肿瘤性疾病及抗感染方面优势明显。
3.1基因工程抗体药物的临床应用
3.1.1 在肿瘤性疾病诊疗方面的应用
放射性标记抗体在肿瘤影像和治疗中很重要，并可有效进行药代动力学评估．以标记抗体注入人体内显示肿瘤部位抗原与抗体结合的放射浓集称放射免疫显像，由于基因工程抗体如单链抗体、Fab片段等分子量小、能很快清除、组织穿透力强，所以更适于放射免疫显像【8】。
恶性肿瘤的导向治疗，是通过重组技术将抗肿瘤相关抗原的抗体与多种分子
融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能．这些分子包括：放射性核素、细胞毒药物、毒素、小肽、蛋白、酶和用于基因治疗的病毒．对肿瘤治疗来说，设计的双特异性抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞毒物质输送到肿瘤细胞．此外，抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEG偶联，从而增强体内运输和药代动力学。作为免疫脂质体，转铁蛋白受体抗体可使药物通过血脑屏障到达大脑．抗体酶复合物作为前体药物也被用于基础肿瘤治疗。3.1.2基因工程抗体的抗感染作用
预防和治疗感染性疾病常用的药物是疫苗和抗生素，但对于一些尚无有效预防及治疗手段的感染性疾病如 SARS、AIDS等，抗体治疗可做为首选方案。如在治疗AIDS方面，利用抗体工程技术已成 功地制备出HIV病毒整合菌的单链抗体ScAb2219，对HIV病毒感染的早期和晚期具有有效的抑制作用，并可望成为S基因治疗的有效手段。呼吸道合胞病毒(RSV)易引起婴儿呼吸道疾病，如细支气管炎和肺炎，并可引起严重的并发症，目前已有人源化单克隆抗体Palivizumab经美国FDA批准上市，临床实验证明无毒、副反应，并可显著降低婴儿的住院率。我国率先建立了针对SARS的基因工程抗体库，这对于 SARS的预防、诊断和治疗都将起到重要作用和深远影响。对于中和其它病原分子，FDA已批准 Fab单体分子作为抗蛇毒药物；scFv片段和寡克隆复合物作为抗细菌毒素药物。3.1.3 细胞内抗体
随着细胞信号转导和抗体工程技术的发展，诞生了细胞内抗体技术。这项技术是指在细胞内表达并被定位于亚细胞区室如胞核、胞浆或某些细胞器，与特定的靶分子作用从而发挥生物学功能的一类新的工程抗体。最典型的是 scFv，被称为内抗体。胞内抗体技术主要应用在抑制病毒复制特别是 HIV-1复制、肿瘤基因治疗方面，现已逐渐拓展到中枢神经系统疾病、移植排斥和自身免疫性疾病等领域。体外培养来源于无关供体的角质形成细胞同种移植物用于严重的烧伤病人的治疗，往往会引起排斥反应，而MHCI类分子是引起移植排斥的重要抗原。Mhashikar等用编码抗 MHC I单链抗体的腺病毒转染角质形成细胞，结果显示明显降低了MHCI的表达，细胞内抗体介导的表型敲除是否有利于同种移植物的存活还需要进一步研究。
3.1.4 用于未来诊断的生物传感器和微矩阵技术
生物传感器和微阵列技术在不久以后将有可能成为主要的体外诊断技术．对于大量诊断试剂盒，抗体有高敏感性和高特异性．从最初的玻璃界面到现在的多种蛋白亲和界面，用于诊断的抗体微矩阵界面不断发展．随着体外机械人的出现，这一技术将进一步发展，并用于微生物污染、寄生虫和生物病原体的检测。
3.2基因工程抗体药物的应用领域
1.肿瘤导向治疗；
2.哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、急性心梗、脓毒症、多发性硬化症及其他自身免疫性疾病； 3.心脑血管疾病； 4.感染性疾病； 5.“生物导弹”
4.基因工程技术的发展方向
针对基因工程抗体药物的应用，明确基因工程技术的发展方向，从而让基因工程抗体对我们更有利[9]。
1.开发针对神经系统、肿瘤、心血管系统、艾滋病及免疫缺陷等重大疾病的多肽、蛋白质和核酸等新生物技术产品；
2.选择一批市场前景好的生物技术产品及疫苗、诊断用单克隆抗体，开发重点是乙肝基因疫苗与单克隆抗体诊断试剂等；
3.开发靶向药物主要是开发抗肿瘤药物。目前治疗肿瘤药物确实存在一个所谓“敌我不分”的问题。在杀死癌细胞的同时，也杀死正常细胞。导向治疗就是针对这个问题提出来。所谓导向治疗就是利用抗体寻找靶标，如导弹的导航器，把药物准确引入病灶，而不伤及其他组织和细胞；
4.人源化的单克隆抗体的研究开发。抗体可以对抗各种病原体，亦可作为导向器，但目前的单克隆抗体，多为鼠源抗体，其本身也被异种生物体视为抗原，当被注入人体后会诱导产生抗体或激发免疫反应。目前国外已研究噬菌体抗体技术，嵌合抗体技术，基因工程抗体技术以解决人源化抗体问题；
5.血液替代品的研究与开发仍然占重要地位。血液制品是采用大批混合的人体血浆制成的，由于人血难免被各种病原体所污染，如艾滋病病毒及乙肝病毒等，通过输血而使接受输血的人感染艾滋病或乙型肝炎的案例时有发生，因此利用基因工程开发血液替代品引人注目。
基因工程抗体的进展已使抗体制备技术进入了一个全新时代，尤其药物抗体库的进展，解决了人源抗体的研制，促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发，可以预见基因工程抗体的研制正在进入一个新的高峰。但是抗体的亲和力减弱，与完整抗体结构相比，功能明显就会降低。人们对可能出现的新组合、新性状会不会影响人类健康和环境，还缺乏知识和经验，按目前的科学水平还不能完全精确的预测。所以我们要在抓住机遇，大力发展基因工程技术的同时，需要严格管理，充分重视转基因抗体的安全性
【10】。
致谢：非常感谢闵令江老师在我大学的学习阶段教给自己基因工程这门学科。我从中学到了很多知识，认识了关于基因工程方面的一些问题，使自己从一无所知到现在基本认识了这门学科，在此我向老师表示我诚挚的谢意，感谢老师的诚
挚教导。
【参考文献】
[1]楼士林，杨盛昌，龙敏南，等。基因工程[M]。北京：科学出版社，2002。
[2]李庆军，董艳桐，施冰。植物抗虫基因的研究进展[J]。林业科技，2002，27(2)：22 26。[3]Avivi I，Robinson S，Goldstone A．C1 inical use of rituximab in haematologica1 ma1ignancies[J]．Br．J．Cancer 2003，89：1389-1394．
[4]Cai X．，et a1．Proc．Nat1[J]．Acad．Sci．，USA 1995，92：6537-6541．
[5]Schi1lberg S．，Fischer R．，Emans N。Molecular farming of recombinant ant [6ibodies in plants[J]．Cel 1 Mo1．Life Sci．2003，60：433-445． ]Bouquin T．，Thomsen M．，Nie1sen L．K．，et a 1．Human ant i— rhesus D IgG1 ant ibody produced in transgenic plants[J]．Transgenic Res．2002，11：115-122．
[7]Wi seman G．A．，Leigh B．，ErwinW．D．，et a1． Radiation dosimetry results for Zevalin radioimmunotherapy of ritux。imab。refractory non—Hodgkin lymphoma．Cancer 2002，94：1 349—1 357． [8]沈孝宇。转基因之争[M]。北京:化学工业出版社,2008。
[9] 李彪;鼠－人嵌合抗体的研制及应用[J];国外医学。放射医学核医学分册;1996年04期。[10] 黄华梁;基因工程抗体的研究[J];中国肿瘤生物治疗杂志。
基因工程在现代社会中的应用与前景
在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，按照人类的需要进行设计，然后按设计方案创建出具有某种新的性状的生物新品系，并能使之稳定地遗传给后代，这就是基因工程。
基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，即“目的基因”。被称为“分子剪刀”的“限制性转切酶”可以在DNA分子上找到特定的“切点”，然后将认准的双链交错切断。自70年代以来，人们已找到400多种形形色色的“分子剪刀”。二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组 DNA。在用同一种“分子剪刀”剪切的两种DNA碎片中加上“分子针线”——“DNA连接酶”，就可以把两种DNA片段重新连接起来。三是把重组DNA引入某种细胞。把“拼接”好的DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种分子小、能自
由进出细胞，而且在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒，因为质粒能自由进出细菌细胞。四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。目的基因的导入过程是肉眼看不到的。因此，要知道导入是否成功，事先应找到特定的标志。例如我们用一种经过改造的抗四环素质粒PSC100作载体，将一种基因移入自身无抗性的大肠杆菌时，如果基因移入后大肠杆菌不能被四环素杀死，就说明转入获得成功了。
科学家曾预言，21世纪是基因工程的世纪。基因工程对人类来说，作用是不可估量的，意义是深远的。
随着人类对基因研究的不断深入，发现许多疾病是由于基因结构与功能发生改变所引起的。科学家将不仅能发现有缺陷的基因，而且还能掌握如何进行对基因诊断、修复、治疗和预防，这是生物技术发展的前沿。这项成果将给人类的健康和生活带来不可估量的利益。
所谓基因治疗是指用基因工程的技术方法，将正常的基因转如病患者的细胞中，以代病变基因，从而表达所缺乏的产物，或者通过关闭或降低异常表达的基因等途径，达到治疗某些遗传病的目的。目前，已发现的遗传病有6500多种，其中由单基因缺陷引起的就有约3000多种。因此，遗传病是基因治疗的主要对象。
基因治疗的最新进展是即将用基因枪技术于基因治疗。其方法是将特定的DNA用改进的基因枪技术导入小鼠的肌肉、肝脏、脾、肠道和皮肤获得成功的表达。这一成功预示着人们未来可能利用基因枪传送药物到人体内的特定部位，以取代传统的接种疫苗，并用基因枪技术来治疗遗传病。
目前，科学家们正在研究的是胎儿基因疗法。如果现在的实验疗效得到进一步确证的话，就有可能将胎儿基因疗法扩大到其它遗传病，以防止出生患遗传病症的新生儿，从而从根本上提高后代的健康水平。
加快农作物新品种的培育
科学家们在利用基因工程技术改良农作物方面已取得重大进展，一场新的绿色革命近在眼前。这场新的绿色革命的一个显著特点就是生物技术、农业、食品和医药行业将融合到一起。
基因技术的突破使科学家们得以用传统育种专家难以想象的方式改良农作物。例如，基因技术可以使农作物自己释放出杀虫剂，可以使农作物种植在旱地或盐碱地上，或者生产出营养更丰富的食品。科学家们还在开发可以生产出能够防病的疫苗和食品的农作物。
基因技术也使开发农作物新品种的时间大为缩短。利用传统的育种方法，需要七、八年时间才能培育出一个新的植物品种，基因工程技术使研究人员可以将任何一种基因注入到一种植物中，从而培育出一种全新的农作物品种，时间则缩短一半。
基因工程自20世纪70年代兴起之后，经过二十多年的发展历程，取得了惊人的成绩，基因治疗
特别是近十年来，基因工程的发展更是突飞猛进。基因转移、基因扩增等技术的应用不仅使生命科学的研究发生了前所未有的变化，而且在实际应用领域——医药卫生、农牧业、食品工业、环境保护等方面也展示出美好的应用前景。
基因工程与医药卫生
目前，基因工程在医药卫生领域的应用非常广泛，主要包括以下方面： 1.基因工程药品的生产：
许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。
微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。⑴基因工程胰岛素
胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。
将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%!⑵基因工程干扰素
干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。
基因工程人干扰素α-2b（安达芬）是我国第一个全国产化基因工程人干扰素α-2b，具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。⑶其它基因工程药物
人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。基因工程药品是制药工业上的重大突破。
目前用基因诊断方法已经能够检测出肠道病毒、单纯疱疹病毒等许多种病毒。
基因工程与农牧业、食品工业
基因工程在农牧业生产上的应用主要是培育高产、优质或具有特殊用途的动植物新品种。基因工程在农业方面的应用主要表现在两个方面。首先，是通过基因工程技术获得高产、稳产和具有优良品质的农作物。例如，用基因工程的方法可以改善粮食作物的蛋白质含量。其次，是用基因工程的方法培育出具有各种抗逆性的作物新品种。自然界中细菌的种类是非常多的，在细菌身上几乎可以找到植物所需要的各种抗性，如抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗盐碱、抗干旱、抗高温等。如果将这些抗性基因转移到作物体内，将从根本上改变作物的特性。
基因工程在畜牧养殖业上的应用也具有广阔的前景，科学家将某些特定基因与病毒DNA构成重组DNA，然后通过感染或显微注射技术①将重组DNA转移到动物受精卵中。由这种受精 卵发育成的动物可以获得人们所需要的各种优良品质，如具有抗病能力、高产仔率、高产奶率和高质量的皮毛等。
在工业上，由于用微生物进行发酵生产要比在大田中进行农牧业生产具有许多优越性，因而它已成为农牧业发展的一个远景方向。而要实现这一目标，基因工程将是最有效的手段。例如，有人设想并正在试验将抗生素生产菌放线菌或霉菌的有关遗传基因转移至发酵时间更短、更易于培养的细菌细胞中；将动物或人产胰岛素的遗传基因转移至酵母或细菌的细胞中；将家蚕产丝蛋白的基因引入细菌细胞中；把人或动物产抗体、干扰素、激素或白细胞介素（interleukin）等的基因转移至细菌细胞中；把不同病毒的表面抗原基因转移到细菌细胞中以生产各种疫苗；用基因工程手段提高各种氨基酸发酵菌的产量；构建分解纤维素或木质素以生产重
要
代
谢
产
物的工
程
菌；
基因工程还可以为人类开辟新的食物来源。
基因工程与环境保护
基因工程的方法可以用于环境监测基因工程还可以用于被污染环境的净化。造成环境污染的农药，并试图通过基因工程的方法回收和利用工业废物。凡此种种，都是一些可望取得成功和发展前景十分光明的研究课题。
例如，目前用100000克胰脏只能提取3～4g胰岛素，而用“工程菌”进行发酵生产，则只要用几升发酵液就可取得同样数量的产品。1978年，美国有两个实验室合作，使E．coli产生大白鼠胰岛素的研究已获成功。接着，又报道了通过基因工程使E．coli合成人胰岛素实验成功的消息。他们在实验室中曾将人胰岛素A、B两链的人工合成基因分别组合到E．coli的不同质粒上，然后再转移至菌体内。这种重组质粒可在E．coli细胞内进行正常的复制和表达，从而使带有A、B链基因的“工程菌”菌株分别产生人胰岛素的A、B链，然后再用人为 的方法，在体外通过二硫键使这两条链连接成有活性的人胰岛素。另外，在1977年，国外已利用基因工程技术，使E．coli生产出一种名为生长激素释放因子“SRIH”的动物激素（一种十四肽，能抑制其他激素的释放和治疗糖尿病等），它原来要从羊的脑下垂体中提取，宰50万头羊也只能提取5mg的产品，而现在只要用10L发酵液就可获得同样的产量。近年来，应用遗传工程获得这类产品的例子正与日俱增，尤其是多肽类物质，如脑啡肽（大脑中的镇痛物质）、卵清蛋白（即“OV”，389肽）、干扰素（用于治疗病毒性感染）、胸腺素α-1（有免疫援助因子的作用，可治疗癌症）、乙型肝炎疫苗和口蹄疫病毒疫苗等。我国学者也急起直追，在脑啡肽、α-干扰素、γ-干扰素、人生长激素、乙型肝炎疫苗、含乙肝表面抗原基因的牛痘病毒株以及青霉素酰化酶等的基因工程研究中，取得了一系列令人鼓舞的成果。
（2）基因工程在农业上的应用基因工程在农业上应用的领域也十分广阔。有人估计，到本世纪末，每年上市的植物基因工程产品的价值，相当于医药产品的十倍。几个主要的应用领域包括：①将固氮菌的固氮基因转移到生长在重要作物的根际微生物或致瘤微生物中去，或是干脆将它引入到这类作物的细胞中，以获得能独立固氮的新型作物品种。根据估算，利用前一方法，其研究经费仅及通过常规方法发展氮肥工业以达到同样效果的二百分之一至二千分之一；而后一途径则更省事，其成本还不到上述的二千分之一；②将木质素分解酶的基因或纤维素分解酶的基因重组到酵母菌内，使酵母菌能充分利用稻草、木屑等地球上贮量极大并可永续利用的廉价原料来直接生产酒精，并可望为人类开辟一个取之不尽的新能源和化工原料来源；③改良和培育农作物和家畜、家禽新品种，包括提高光合作用效率以及各种抗性基因工程（植物的抗盐、抗旱、抗病基因以及鱼的抗冻蛋白基因）等。
基因工程的前景
从70年代起逐步建立起来的基因工程技术，使基因或一些具有特殊功能的DNA片段的分离变得十分容易。这些基因或特殊DNA片段的一级结构（即它们的核苷酸序列）的测定也是十分容易的，由基因的核苷酸序列去推测蛋白质的氨基酸残基的序列也变得轻易而举。利用计算机技术可以很容易的对推测出来的蛋白质进行高级结构的分析，可以对来自不同生物种类的基因序列进行同源性分析。所有这些方法或技术的广泛使用，不仅大大地推动了分子生物学的迅猛发展，而且也大大推动了生命科学各个分支领域的迅速发展。因此，基因工程技术的第一个重要应用领域就是大大的推动了科学理论研究的发展。
由于基因工程是从遗传物质基础上对原有的生物（常常称之为受体生物）进行改造，经过改造的生物就会按照研究者的意愿获得某种（些）新的基因，从而使该生物获得某些新的
遗传性状。这种性状可以用人的肉眼直接观察到，也可能是通过某些反应或仪器间接观察到。这种受体生物可能是微生物，植物或动物，因而它会涉及到许多生产行业。
基因工程技术几乎涉及到人类的生存所必需的各个行业。比如将一个具有杀虫效果的基因转移到棉花、水稻等农作物种中，这些转基因作物就有了抗虫能力，因此基因工程被应用到农业领域；要是把抗虫基因转移到杨树、松树等树木中，基因工程就被应用到林业领域；要是把生物激素基因转移到支物中去，这就与渔业和畜牧业有关了；如果利用微生物或动物细胞来生产多肽药物，那么基因工程就可以应用到医学领域。总之一句话，基因工程应用范围将是十分广泛的
第五篇：基因工程论文
学号：13054107
基因工程结课论文
靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体构建
院（系）名
称： 理学院 专业
名
称： 生物科学 学
生
姓名： 姜己玉 所
在班
级： 13-1
目录
摘要............................................................................................................................................2 第一章 绪论..............................................................3 1..1RNAi的研究进展....................................................3 1.1.1RNAi的分子作用机制...........................................3 1.1.2 RNAi 的特点..................................................3 1.1.3 siRNA简介.........................................................3 1.1.4 s iRNA 的设计原则..........................................3 1.2 用于 RNA i 的载体....................................................4 1.2.1 载体的选择..................................................4 1.2.2 质粒人工构建的目的.................................................4 1.3 MRP1 的研究进展......................................................4 第二章 实验材料与方法.....................................................5 2.1 实验材料.............................................................5 2.1.1 宿主菌.............................................................5 2.1.3 载体通用引物................................................5 2.1.5 主要仪器..........................................................5 2.2 试验方法.........................................................5 2.2.1 shRNA 的设计与退火..................................................5 2.2.2 合成干涉片段的退火..........................................6 2.2.3 重组载体的构建..............................................6 2.2.4 菌落PCR初步筛选阳性重组子..................................7 2.2.5 测序鉴定重组载体...............................................7 第三章 结果与分析.........................................................8 3.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后胶回收结果...........................8 3.1.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后结果.............................8 3.1.2 目的片段的回收................................................8 3.2 重组质粒的菌落PCR...................................................8 3.3 重组质粒大量提取......................................................8 3.4 重组质粒测序结果.................................................8 参考文献..................................................................9
摘 要
癌症严重威胁着人类的健康，其发病率呈上升趋势。化疗作为其常规临床治疗手段，在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替代的作用。肿瘤细胞的多药耐药性（multidrug resistance, MDR）是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂，多药耐药相关蛋白1（Multidrug Resistance-associated Protein 1，MRP1）的过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的能快速、高效、特异的沉默目的基因表达的技术，如能通过RNAi技术沉默MDR1基因，逆转肿瘤细胞的多药耐药性将为改善癌症病人的化疗效果奠定基础。
目的：本课题选用pRNAT-H1.1/shuttle-RFP表达穿梭载体。构建针对mrp1 mRNA的RNA干扰表达载体。
方法：将预先根据MRP1基因序列设计合成的编码siRNA的cDNA序列与pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒载体连接，构建靶向mrp1 siRNA重组质粒。将重组质粒转化E.coli DH5α后大量提取重组质粒，经菌落 PCR和 DNA测序分析检测重组载体构建结果。
结果：成功构建靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体。为下一步抑制mrp1基因在肿瘤细胞中的表达奠定基础。
关键词：RNA干扰；MRP1；pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒；穿梭载体
第1章 绪 论
1.1 RNAi的研究进展
RNA干扰(RNA interference , RNAi)是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程，为一种双链RNA分子在mRNA 水平上关闭相关基因表达的过程，是一项新兴的基因阻断技术。RNAi有望成为分析人类基因组功能的有力工具，在肿瘤病因、免疫机制及治疗等方面的研究上有广阔的发展前景。
1.1.1 RNAi的分子作用机制
RNAi的作用机制在众多学者的努力研究下日渐明朗。不同生物体内的RNA干扰作用机制也各有不同，但是主要可以分为两种类型：特异效应作用机制与非特异效应作用机制。特异性效应一般发生在短双链RNA（21～23nt）上，非特异性效应发生于长双链RNA（30nt以上）。
1.1.2 RNAi的特点
RNAi具有高效性，也就是说与细胞内的mRNA的量相比，注入细胞内的siRNA的量要少得多。但由于循环放大机制的存在，仍可以有效地阻断目的基因的表达；同时，RNAi也具有高特异性，小干扰RNA由dsRNA降解得到的，除在序列识别中不起主要作用的正义链3′端的两个碱基以外，其余碱基均为必需。
1.1.3 siRNA简介
RNA干扰作用是通过siRNA（small interfering RNA，siRNA）这类小RNA分子作为较稳定的中间介质实现的。通过对植物的研究证明，双链RNA复合体降解为35nt左右的小RNA分子后通过序列互补与mRNA结合，进而降解mRNA。
1.1.4 siRNA的设计原则
RNAi 作用的成功与否，关键在于siRNA序列的结构，不同结构的siRNA序列沉默基因的效率差别很大，2001年，Elbashir S M等[应用化学合成法合成了siRNA，并发现可以诱导哺乳动物发生RNAi，他们进而据此提出了siRNA 设计方法：1)从起始密码下游50~100nt开始搜索siRNA以避免出现于5′或3′端的UTRs 的蛋白结合位点，；
2)搜索5′AA(N19)UU序列，如果没有相应序列，可以选择5′AA(N21)或5′NA(N21)；3)G/C含量在32%~79%之间[16]； 4)要确定siRNA对靶基因的特异性，可以利用Blast软件在基因组中进行比对，；5)设置在基因组中无对应序列的siRNA的对照siRNA。但是，Elbashir S M等的设计方法siRNA 筛选效率仍然很低，要更好的掌握RNAi。
1.2 用于RNAi的载体
基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具，称为载体。是指能够运载外源DNA片段进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。载体具有以下的功能：（1）运送外源基因高效转入受体细胞；（2）为外源基因提供复制能力或整合能力；（3）为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
1.2.1载体的选择
质粒是为一种1-200kb不等的双链、闭环的DNA分子。是染色体外稳定遗传，并能以超螺旋状态存在于宿主细胞中的因子。RNA干扰实验通常选用质粒作为载体。质粒载体是为适应实验室操作在天然质粒的基础上人工构建的。但是，天然质粒的缺点是分子量大，拷贝数低，所以为使分子量尽可能减少，必须去掉大部分的非必需序列，以便于基因工程操作。
1.2.2 质粒人工构建的目的
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建
1.3 MRP1的研究进展
MRP1的底物 直接通过细胞毒性分析和底物刺激的ATP酶测量进行识别MRP1的底物的，底物是由大量的多样化的疏水复合物，有机阴离子结合物以及阴离子非结合性底物所组成。典型的结合型底物包括：谷胱甘肽，葡糖醛酸和硫酸盐结合物，MRP1的组织分布 MRP1在体内的表达可以说是无所不在。
第2章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 宿主菌
E.coli DH5α：为感受态宿主菌由北京鼎国生物技术有限责任公司提供。
2.1.2 质粒载体
pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒。pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒特性如下：pRNAT-H1.1/shuttle 是一种腺病毒siRNA穿梭质粒，shRNA的表达由人的转录启动子H1 Promoter启动，H1启动子属于PolⅢ启动子，该启动子总在其下游的固定距离开始转录合成RNA，转录过程遇到4~5个连续的U即终止，非常精确；同时CMV Promoter为真核生物启动子，可在该质粒中高效启动红色荧光蛋白的表达；MCS为多克隆位点。
2.1.3 载体通用引物
正向引物（M13）：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ 反向引物（Rev）：5′-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3′
2.1.4 主要试剂、具酶及仪器
质粒快速提取试剂盒，Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒，10×PCR buffer，dNTP，Marker(1kb,100bp)，Goldview DNA染料，EDTA Bio Basic Inc 溶菌酶，LiCl Amresco RNase Sigma bacto-typtone Bio Basic Inc bacto-yeast extract Bio Basic Inc PEG8000，HindⅢ NEB，BamHI NEB，T4DNA连接酶 NEB，Taq酶，微量振荡器（MM-2型），微量振荡器（MM-2型），恒温空气摇床，电子天平，紫外分析仪（ZF型），低温离心机（SK18），低温离心机（SK18），PCR仪（9600型），ABI 恒温磁力搅拌器（2003-16），恒温水浴锅，自动双重纯水仪
2.2 实验方法
2.2.1 shRNA的设计与退火
根据siRNA设计原则[34]，根据MRP1靶序列，设计合成四对互补反向重复脱氧核糖核酸序列，中间间隔9nt茎环序列(TTCAAGAGA)，5′端带有BamHⅠ酶切位点，3′端带有HindⅢ酶切位点，用BLAST进行同源性分析，确定与其他基因无同源性。shRNA的 5
DNA模板由上海生工合成，单链干涉片段退火后形成双链。根据2个靶序列设计的2对DNA干涉片段mrp1-1，mrp1-2。
2.2.2 合成干涉片段的退火
合成片段的退火体系：各管混匀后90℃保温3分钟，37℃保温1h，再取5μL退火溶液加45μL 灭菌双蒸水混匀，使干涉片段终浓度为8ng/μL。
2.2.3 重组载体的构建
（1）将含有pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒的大肠杆菌接种入盛有200mL LB培养基（含2μg/mL氨苄青霉素）的500mL三角瓶中，置37℃振荡培养过夜（置摇床中160r/min）。（2）实验前预先配制溶液Ⅱ，溶菌酶。预冷溶菌酶、溶液Ⅰ和溶液Ⅲ。取出菌悬液，观察菌体生长状况，将菌悬液分装于两个250ml离心桶中，调平。预冷离心机至4℃，4℃下8000r/min离心5min，弃上清，得菌体。（3）加预冷的溶液Ⅰ50ml于每离心桶，混匀，洗涤沉淀。8000r/min离心5min，弃上清，得沉淀。此步骤的目的为出去培养基，以获得更纯的细菌沉淀物。（4）用17ml溶液Ⅰ吹散重悬细菌沉淀物，加3ml新配制的溶菌酶溶液，温和混匀，室温放置10min，裂解大肠杆菌。（5）加40ml新配制的溶液Ⅱ，以使菌体破碎，释放质粒DNA等内容物。缓慢颠倒数次，防止破坏基因组DNA，室温放置3min。（6）加30ml预冷的溶液Ⅲ，缓慢颠倒数次，防止SDS破坏基因组DNA，冰浴放置15min。4℃下以10000r/min离心10min，然后将上清液全部倒入新离心桶中。（7）将上清液在4℃下以10000r/min离心10min，然后将上清液经8层纱布过滤至新离心桶中。（8）加0.6倍体积（约54ml）的异丙醇，充分混匀，室温放置15min，以沉淀核酸。8000r/min离心15min，小心倒掉上清，敞开瓶口倒置于纸巾上，使残余上清液流尽，晾干。（9）加15ml水再加15ml LiCl（预冷）混匀，静置沉淀15min，4℃下10000r/min离心15min，以出去蛋白质和RNA。（10）倒上清于新的离心桶中，加30ml异丙醇，剧烈震荡，静置沉淀15min，在4℃下以10000r/min离心15min。再次沉淀核酸。（11）弃上清，得到沉淀的核酸。敞开瓶口倒置于纸巾上使残余上清液流尽。（12）用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下以10000r/min离心5min，弃去乙醇，离心桶敞口倒置于纸巾上，使乙醇挥发殆尽。此步骤可以沉淀DNA。（13）加2ml无菌水溶解沉淀，将液体吸到10ml离心管中，再吸2ml ddH2O冲洗瓶壁，随后将洗液加到同一10ml离心管中，随后加100µl RNaseA，37℃，水浴30min。以使RNA彻底分解。（14）加等体积含13％（w/v）聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于4℃以12000转/分，离心15分钟，以回收质粒DNA。（15）沉淀用3ml70%乙醇重悬清洗，以除去PEG，12000r/min离心8min。（16）重复上步操作，将离心管倒扣于纸巾上10min，加1ml H2O溶解，用等体积酚/氯仿/异戊醇再抽提一次蛋白质，室温下8000r/miin离心10min。（17）小心吸上清与另一离心管中，加2倍体积的预冷无水乙醇，再加0.1体积的NaAC（3mol，pH5.2），冰上沉淀20min，4℃下10000r/min离心15min，使DNA沉淀出来。（18）去上清加入3ml 70%乙醇重悬清洗，10000r/min 离心15min，晾干，用500µl无菌水溶解沉淀。
2.2.4菌落PCR初步筛选阳性重组子
灭菌牙签挑取LB筛选平板上圆滑单菌落，先在预先分隔并标记的另一LB平皿上划板，然后点入制备好的PCR反应混合液，开始扩增。PCR反应条件为：94℃预变性2分钟；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸45s，共35个循环；72℃ 延伸1分钟，4℃保存，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。划板的平皿于37℃培养12-16h。
2.2.5 测序鉴定重组载体
将小提鉴定结果正确的质粒送交上海生工生物工程技术服务有限司，以载体反向引物为测序引物。将经鉴定后未发生突变的H1.1-
1、H1.1-2靶向MRP1基因siRNA重组质粒的宿主菌摇瓶扩大培养后，进行质粒大量提取,方法如2.1.2.3.1所述。
第3章 结果与分析
3.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后胶回收结果
3.1.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后结果
pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒经HindⅢ和BamHI双酶切，结果显示单酶切产物大小约为6200bp，双酶切产物略小于单酶切产物，与预期结果相符。
3.1.2 目的片段的回收
目的片段回收 ,结果显示回收产物大小约为6Kb，与预期结果相符。
3.2 重组载体的菌落PCR 重组载体菌落 PCR电泳，结果显示PCR扩增产物,电泳分析发现阳性产物可以扩增出560bp大小的条带，假阳性产物不能扩增出560bp大小的条带,与预期结果相符，可以初步筛选出阳性产物。
3.3 重组质粒大量提取
重组质粒大量提取后的电泳，结果显示pRNAT-H1.1/shuttle-RFP 重组质粒大小约为6.2kb，与预期结果相符。
重组质粒大提并稀释50倍以后在紫外分光光度仪Genespec上测其OD值。
3.4 重组质粒测序结果
pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒测序鉴定，结果显示重组质粒的碱基序列与预期结果一致，未发生碱基突变，说明pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒构建成功。
参考文献
[1] 张淑华.小干扰RNA靶向VEGF基因在体内外抑制乳腺癌细胞增殖的研究[D].青岛:青岛大学硕士，2007.[2] Sharp PA.RNA interference-2001.Genes Dev.2001, 15: 485-490.[3] 康洁, 刘福林.RNAi的抗病毒作用及其机制[J].现代免疫学, 2004, 24(5): 439-441.[4] 林少微,王雪华,郑高哲等.RNAi的研究进展 [J].中国医药导报, 2007, 4(29)_3.[5] 黄艳敏,贾欣秒.RNA干扰技术的研究进展 [J].河北化工, 2009, 32(1):213-216.[6] 邓庆.E2F8及肿瘤-睾丸(CT)基因在肝癌中作用的研究[D].上海交通大学硕士.2009.[7] 赖长城.人类Pin1在食管癌组织中的表达[D].福建:厦门大学硕士.2008.[8] 魏群，分子生物学实验指导（第二版）[Q]2007,11:3.[9] 陈爱葵,李梅红.RNAi的研究及应用 [J].广东教育学院学报, 2008, 28(3):5.[10] 王光海.MRP1与肺癌耐药.临床肺科杂志[J].2005,5，（3）：367.
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