基因工程药物论文

第一篇：基因工程药物论文

基因工程药物

姓名：陈剑云 学号：U201210914 班级：机械学院测控1204班

摘要：自１９７２年ＤＮＡ重组技术诞生以来，生命科学进入了一个崭新的发展时期。１９８２年美国礼莱公司推出基因工程胰岛素，这是第一个人用基因工程药物。从那时起，以基因工程为核心的现代生物技术已应用到农业、医药、化工、环境等各个领域。基因工程技术的迅速发展不仅使医学基础学科发生了革命性的变化，也为医药工业发展开辟了广阔的前景，以ＤＮＡ重组技术为基础的基因工程技术改造和替代传统医药工业技术，已成为重要的发展方向。

关键词：基因工程制药应用

基因的定义：基因是脱氧核糖核酸（DNA）分子上的一个特定片段。不同基因的遗传信息，存在于各自片段上的碱基排列顺序之中。基因通过转录出的信使使核糖核酸（mRNA），指导合成特定的蛋白质，使基因得以表达。

基因工程定义：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程药物定义:基因工程药物又称生物技术药物,是根据人们的愿望设计的基因,在体外剪切组合,并和载体DNA 连接,然后将载体导入靶细胞(微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞),使目的基因在靶细胞中得到表达,最后将表达的目的蛋白质纯化及做成制剂,从而成为蛋白类药或疫苗。

基因工程药物的发展历程：自1972年DNA重组技术诞生以来,作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展。1982年美国Lilly公司首先将重组胰岛素投放市场,标志着世界第一个基因工程药物的诞生。美国是现代医药生物技术的发源地,也是率先应用基因工程药物的国家,其基因工程技术研究开发以及产业化居于世界领先地位。美国已拥有世界上一半的生物技术公司和一半的生物技术专利。据1998年美国药学会统计,美国FDA已批准了56种生物技术医药产品上市,其中绝大多数为基因工程药物。此外,还有200多种基因工程药物正在进行临床试验,其中至少有1/5的产品将可能在今后10年内上市。基因工程药物为美国的一些公司创造了丰厚的回报,取得了巨大的经济效益和社会效益。欧洲在发展基因工程药物方面也进展较快,英、法、德、俄等国在开发研制和生产基因工程药物方面成绩斐然,在生命科学技术与产业的某些领域甚至赶上并超过了美国。我国基因工程药物的研究和开发起步较晚,直至20世纪70年代初才开始将DNA重组技术应用到医学上,但在国家产业政策的大力支持下,这一领域发展迅速,逐步缩短了与先进国家的差距。1989年我国批准了第一个在我国生产的基因工程药物———重组人干扰素重组人干扰素αIb,标志着我国生产的基因工程药物实现了零的突破。重组人干扰素αIb是世界上第一个采用基因克隆和表达的基因工程药物,也是到目前为止唯一的一个我国自主研制成功的拥有自主知识产权的基因工程一类新药。从此以后,我国基因工程制药产业从无到有,不断发展壮大。截止1998年底,我国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品共计15种，国内已有30余家生物制药企业取得基因工程药物或疫苗试生产或正式生产批准文号。至2000年,我国已有200多家生物技术公司,有20多家生产销售人干扰素、白细胞介素、乙肝疫苗等12种基因工程药物。

基因工程药物的本质是蛋白质，生产基因工程药物的方法是：将目的基因连接在载体上，然后将导入靶细胞（微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中的到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯做成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。若目的基因直接在人体组织靶细胞表达，就称为基因治疗。

基因治疗：基因治疗就是从遗传物质本身，即基因入手，不必产生或纯化基因的最终产物，而是将基因，通常是通过一个载体直接导入人体，再利用人体自身就具有的基因复制、转录与翻译功能来产生这些产物，达到补充正常基因产物或对抗异常基因的目的。将基因导入哺乳类动物细胞的方法有两种，一类是理化方法，一类是病毒介导的DNA转移。

利用基因工程技术生产药品的优点在于：大量生产过去难以获得的生理活性物质和多肽；挖掘更多的生理活性物质和多肽；改造内源生理活性物质；可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。

基因药物的发展前景

与传统制药相比，生物制药有便于大规模生产、利润高、生产工艺简单、人力投入少、无污染、生产周期短等优点，因此，随着人类基因组计划的实施和科技水平的进一步发展，基因药物在医药市场的比例也将会日益提升，也将越来越影响人类的生活。

基因药物同时具有高投入、高收益、高风险、长周期的特征。Frost&Sullivan公司的一份最新报告指出，2004年，全球生物制药市场的收入为450亿美元。到2011年，其有望达到982亿美元。据预测，全球第一个用转基因植物生产的生物药物可望于2005～2006年上市。随着公众认知度的提高和相关法规的逐步完善，用转基因植物生产生物药物的市场将飞速增长，到2011年，单美国市场就将达到22亿美元。2002年底到2003年5月间一场突如其来的SARS疫情，再加上2005年度禽流感病毒传播，席卷了亚洲及加拿大等地。在紧张而又严肃的应对这场疫情的过程中，生物制药又成为医药行业人士关注的焦点。

我国生物制品需求巨大，过去的几年我国企业一直能保持年均15％以上增幅，并且近年来销售的增长速度有加快的趋势。据统计，2005年国内生物制品销售收入总额为157．4亿元人民币，销售利润总额为38.7亿元人民币。预计到2006年生物技术工业总产值将达400亿到500亿元，到2015年总产值可达1100亿到1300亿元。我国的生物制药业将进入一个快速发展的阶段,生物医药工业将成为医药产业增长最快的部分。目前,我国许多省市已将生物制药作为本地的支柱产业重点扶持。一大批生物医药科技园相继在各地高新技术开发区建成。面对入世带给我国生物制药业的挑战和机遇,专家们预测,在未来若干年,我国的生物制药业将以超过全球平均增长速度步入高速发展轨道,前景十分广阔。

基因工程药物的发展概况

20世纪70年代，随着DNA重组技术的成熟，诞生了基因工程药物，高产值、高效率的基因药物给医药产业带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展，医药产业进入了新的历史时期。基因药物经历了三个阶段：第一阶段是把药用蛋白基因导入到大肠杆菌等细菌中，通过大肠杆菌等表达药用蛋白但这类药物往往有缺陷，人类的基因在低等生物的细菌中往往不表达或表达的蛋白没有生物活性。第二阶段是人们用哺动物的细胞代替细菌，生产第二代基因工程药物。第三阶段是到了80年代中期，随着基因重组和基因转移技术的不断发展和完善，科学家可以将人们所需要的药用蛋白基因导入到哺乳动物体内，使目的基因在哺乳动物身上表达，从而获得药用蛋白。

基因工程技术制药展望

基因工程技术在医药工业中的应用非常广泛，利用基因工程技术开发药物已成为当前.最为活跃和迅猛发展的领域。随着人类基因组计划的完成，以及基因组学、蛋白质组学、生物信息学等研究的深入，为医药生物技术开拓了一个新的领域，基因工程制药将有更多机会获得突破性进展，为保障人类健康做出更大的贡献。

参考文献：

[1] 张天民,基因工程药物浅释[J].山东肉类科技,1997,1． [2] 李拥军,基因工程药物及其产业化发展[J].生产力研究,2003,3：185.[3] 阚劲松,吴克,基因工程制药研究进展[J].合肥联合大学学报，2000,10(4):108.[4] 唐冬生，夏家辉，新型基因工程药物[J].生命科学研究，1999,3(2):93.[4] 袁建民等,动物乳腺生物反应器研究进展,中国农学通报,2006.22(2):20.[5] 韩玉刚，李建凡，动物生物反应器的现状和进展[J].国外畜牧科技，2002，29(1):30-33

[6] 张忠诚,动物乳腺生物反应器的原理及研究进展,中国奶牛,2006,4：29.[7] 孔秀英 ,孙秀杰，基因治疗，生物学杂志[J].2005,7(2):63.[8] 陈诗书，人类基因治疗研究的新进展，生物工程进展[J].1994,14(1)：30.[9] 张明徽，基因治疗的现状与展望，世界科学[J].1995，10：20-21.[10] 罗登，基因治疗新时期，生物工程进展，1994，14(4)：28-29.[22] 胡蝶，廖静．基因芯片技术在肿瘤研究中的应用[J].首都医科大学学报，2004，25(1)：1 29．

[11] 陆祖宏，何农跃，孙啸．基因芯片技术在基因药物研究和开发中的应用[J].中国药科大学学报．2001，32(2)：81．

第二篇：基因工程药物教学大纲（范文）

基因工程药物教学大纲

课程名称：基因工程药物

课程编号：0235203 学分：1.5 学时数：28

考核方式：N+2。笔记10%，考试成绩占40%，过程成绩N占50%。先修课程：生物化学、微生物学、基因工程等。课程说明：专业选修课。

一、课程的性质

基因工程技术, 不仅使整个生命科学的研究发生了前所未有的深刻变化, 而且也给工农业生产和国民经济发展带来了巨大的经济和社会效益, 给人类进步带来了新的契机。目前，基因工程学正以新的势头继续向前迅猛发展, 成为当今生物科学研究诸领域中最具生命力、最引人注目的前沿学科之一, 特别是基因工程在医药生物技术领域中的研究和应用，其意义深远、潜力之巨大。

二、课程的目的与教学基本要求

课程目的：为了适应生物工程技术的迅速发展、拓宽专业面, 为了使学生对当今世界生物工程领域日新月异地发展的高新技术有更多的了解, 进一步扩大学生的知识面和视野，同时为他们今后从事这方面的工作和研究打下一定理论基础, 特开设该课程。

课程任务: 通过讲授基因工程制药的概貌及国内外研究进展、基因工程制药常用的工具酶和克隆载体、基因工程药物无性繁殖系的组建以及基因工程药物的生产和质量控制等, 使学生对基因工程的基本理论、基本步骤和操作技术以及基因工程药物的生产技术原理和方法有比较系统的了解, 初步掌握基因工程制药有关基本知识。

三、课程适用专业

本课程适用于生物技术专业等相关专业。

四、教学内容、要求与学时分配

第一章 基因工程制药概述(2学时)

第一节：基因工程的概貌 简述基因工程的诞生和兴起，基因工程的定义、特点与基本步骤，基因工程早期的开创性研究成就，基因工程的应用与发展趋势等。

第二节：基因工程与生物制药 简述基因工程药物的研究和发展概况，介绍应用基因工程和蛋白质工程技术研究开发的几种新型基工药物。

第二章 基因工程制药常用的工具酶(2学时)

第一节：限制性核酸内切酶 简述限制酶的发现、限制酶的种类、限制酶的命名和限制酶的特性与用途等。

第二节 DNA连接酶 重点介绍DNA连接酶连接作用的特点，基因工程中常用的连接酶(T4噬菌体DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶)的酶活性和用途，DNA连接酶连接作用的分子机理。

第三节 DNA聚合酶 重点介绍大肠杆菌DNA聚合酶

1、Klenow大片段酶、T4噬菌体DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶及、反转录酶等的酶活性和用途。

第四节 DNA修饰酶 重点介绍末端脱氧核苷酸转移酶、碱性磷酸酶、T4噬菌体多核苷酸激酶等的酶活性和用途。

第五节 单链核酸内切酶 重点介绍S1核酸酶、Bal31核酸酶等的酶活性和用途。

第三章 基因工程制药常用的克隆载体(4学时)第一节 质粒载体 内容：质粒的定义、质粒DNA分子的特性、质粒载体的改造及构建。重点介绍基因工程制药中常用的几种质粒载体的结构和用途，主要包括pBR322及其衍生栽体、pUC系列载体。

第二节 λ噬菌体载休 内容：λ噬菌体的基本特性、λ噬菌体基因组的结构与功能、λ噬菌体DNA的改造及其载体的构建。重点介绍基因工程制药中常用的几种λ噬菌体载体，主要包括 Charon系列载体、EMBL系列载体、λgt系列载体。

第三节 M13噬菌体载体 内容包括：M13噬菌体的基本特性、M13丝状噬菌体载体的构建、常用的M13噬菌体载体，主要包括M13mp18和M13mp19载体。

第四节 粘粒（Cosmid）载体 内容：粘粒载体的构建、常用的粘粒载体。

第五节 哺乳动物细胞载体系统 主要介绍：SV40载体、BPV载体、EBV病毒载体。

第四章 目的基因的制取(2学时)

第一节 目的基因的化学合成 内容：目的基因的设计, 寡聚核苷酸片段的合成, 寡核苷酸片段的分离和纯化, 用寡核苷酸片段组装目的基因, 化学合成寡核苷酸的其它用途。

第二节 构建基因文库法分离目的基因 内容：构建基因文库法分离目的基因的基本步骤, 真核基因组DNA文库的构建过程

第三节 酶促合成法制取目的基因 内容：真核生扬细胞中的mRNA, 从构建 的cDNA文库中筛选目的cDNA, RT-PCR法合成目的cDNA。

第五章 目的基因与克隆载体的体外重组(2学时)

第一节 目的基因与质粒载体的连接 内容：粘性末端连接法, 定向克隆法,平末端连接法, 同聚物加尾法, 加人工接头连接法, 加DNA衔接物连接法, 其它转换末端形式连接法。

第二节 目的基因与噬菌体载体的连接 内容包括：噬菌体载体臂DNA的制备, 噬菌体载体臂与外源目的DNA片段的连接。

第六章 重组克隆载体引入受体细胞(2学时)

第一节 概述 内容：基因工程的受体细胞, 重组体分子导入受体细胞的途径。

第二节 重组体DNA分子的转化或转染 内容包括：用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法, 用复合剂制备感受态细胞转化法, 高压电穿孔转化法。

第三节 重组噬菌体DNA的体外包装与转染 内容：噬菌体体外包装的基本原理, 噬菌体DNA的体外包装, 包装提取物的制备, 重组DNA的体外包装与感染方法。

第四节 重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染

第七章 含目的基因重组体的筛选、鉴定与分析(6学时)

第一节 重组体(菌)的筛选 内容：抗生素抗性基因插入失活法, b-半乳糖苷酶 基因插入失活法, 快速细胞破碎与凝胶电泳筛选法, 放射性标记核酸探针杂交筛选法, 免疫化学筛选法。

第二节 重组体的鉴定 内容：酶切及凝胶电泳鉴定法, Southern印迹杂交法, 电镜R-环检测法, 基因产物鉴定法。

第三节 重组DNA的序列分析 内容：Sanger双脱氧链终止法DNA测序, Maxam-Gilbert化学修饰法DNA测序。

第八章 目的基因在宿主细胞中的表达(2学时)

第一节 外源目的基因在原核细胞中的表达 内容：原核基因表达载体的构建, 常见的原核细胞表达载体系统, 外源目的基因在原核细胞中的表达形式, 在原核细胞中高效表达目的基因, 基因定点诱变技术。

第二节 外源目的基因在真核细胞中的表达 内容：真核细胞表达载体的功能元件, 酵母菌表达系统, 哺乳动物细胞表达系统。

第九章 基因工程无性繁殖系的组建(2学时)

内容：人胰岛素原融合蛋白重组菌的组建, 人a2b型干扰素工程菌的组建, 集落刺激因子工程菌的组建, 白细胞介素融合蛋白工程菌的组建, 乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建, 人组织型纤溶酶原激活剂细胞株的组建, 红细胞生成素CHO细胞株的组建, 人肿瘤坏死因子昆虫细胞株的组建。

第十章 基因工程药物的生产(2学时)

第一节 基因工程菌（细胞）的培养与发酵 内容包括：工程细菌的培养与发酵, 工程酵母的培养与发酵, 工程细胞的培养与发酵。

第二节 基因工程药物的分离纯化 内容包括：影响分离纯化工艺的主要因素, 各种产物表达形式采用的分离纯化方法,。

第三节 基因工程药物的分离纯化实例 内容包括：以包涵体形式表达的rGM-CSF中试分离纯化, 以分泌型表达的人a1-干扰素的分离纯化, 以可溶性形式表达的rhG-CSF的分离纯化, 在酵母中表达的HBsAg的分离纯化。

第十一章 基因工程药物的检验(学生自学)

第一节 基因工程药物的质量控制 内容包括：主要的基因工程药物, 基因工程药物的特点, 基因工程药物的质量要求, 基因工程药物的质控要点, 基因工程药物的制造及检定规程。

第二节 基因工程药物常用的检验方法 内容：化学检定法, 肽图分析法，外源性DNA残留量的测定，宿主细胞蛋白杂质的检测，无菌试验，内毒素试验，异常毒性试验，热原质试验，生物学活性(效价)检定。

第三节 主要基因工程药物的检验 内容：重组人胰岛素的检验，重组人生长激素的检验，重组人干扰素的检验，重组人白细胞介素的检验，重组人红细胞生成素的检验，重组人集落刺激因子的检验，重组人组织型纤溶酶原激活剂的检验, 重组人肿瘤坏死因子的检验，重组乙型肝炎疫苗的检验。

五、教材和主要参考资料

理论教学教材： 《基因工程》, 杨汝德主编，华南理工大学出版社，2006.8 主要参考教材： 《基因克隆技术在制药中的应用》, 杨汝德主编，化学工业出版社，2004.1

执笔人：阚劲松

教研室：

系主任审核签名：

第三篇：基因工程药物开发利用前景

基因工程药物开发利用前景

摘 要：生物制药是以基因工程为基础的现代生物工程，即利用现代生物技术对DNA进行切割、连接、改造，生产出传统制药技术难以获得的生物药品。而现代生物技术是以基因为源头，基因工程和基因组工程为主导技术，与其他高技术相互交叉、渗透的高新技术。比尔·盖茨预言：下一个首富可能是从事生物技术的投资者。本文简要分析了国内外基因工程药物开发的现状和前景。

以基因工程，细胞工程，发酵工程和酶工程为主体的现代生物技术是70年代开始异军突起的高新技术领域，近一，二十年来发展极为神速，它与微电子技术，新材料和新能源技术并列为影响未来国计民生的四大科学技术支柱，被认为是21世纪世界科学技术的核心。现代生物技术又是一项与医药产业结合极为密切的高新技术，它的发展已带给了某些医学基础学科的革命性变化，并给医药工业开辟了更为广阔的心领域。

自1982年全世界第一个基因重组医药产品“人胰岛素”在美国面市以来，至今已有数十个生物技术药物上市。现代生物技术开辟了人体内源性多肽，蛋白质药物的新天地。于此同时它也正渗透到传统医药的哥哥领域，以抗生素，氨基酸，细胞融合及基因工程菌，化学合成药物的生物转化性，到单克隆抗体靶向制剂等等。不久之前美国的Eli Lilly公司又提出了生物技术在医药上的更大应用，是在新药研究筛选方法上的革命，即用基因工程受体实验代替传统的动物实验，所有这一切都表明了医药产业的技术基础正在发生战略性的变革。世界各大医药企业已瞅准目标，纷纷投入巨资围绕以现代生物技术为核心的产品和技术结构开拓，展开了面向21世纪的空前激烈的竞争。基因药物的前沿技术及部分基因药物

基因药物的直接体内基因治疗发展迅速,新型基因药物不断产生。现着重介绍对效果比较肯定关于基因药物的几项前沿技术，基因疫苗、反义RNA 药物、三链DNA 药物这三种新型基因药物技术的基本方法。1.1基因疫苗

基因疫苗的免疫方法即基因疫苗的给药途径,目前使用的方法有以下几种:（1）裸DNA 直接注射:将裸质粒DNA 直接注射到机体的肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内。这种方法简单易行。

（2）脂质体包裹DNA 直接注射:包裹DNA 的脂质体能与组织细胞发生膜融合,而将DNA 摄入,减少了核酸酶对DNA 的破坏。注射途径同裸DNA直接注射。

（3）金包被DNA 基因枪轰击法:将质粒DNA 包被在金微粒子表面,用基因枪使包被DNA 的金微粒子高速穿入组织细胞.。

（4）繁殖缺陷细菌携带质粒DNA 法:选择一种容易进入某组织器官的细菌,将其繁殖基因去掉,然后用质粒DNA 转化细菌,当这些细菌进入某组织器官后,由于不能繁殖,则自身裂解而释放出质粒DNA。1.2反义RNA 反义RNA 指与mRNA 互补后,能抑制与疾病发生直接相关基因的表达的RNA。它封闭基因表达,具有特异性强、操作简单的特点,可用来治疗由基因突变或过度表达导致的疾病和严重感染性疾病,反义RNA 治疗的基本方法有： 1)反义寡核苷酸：体外合成十至几十个核苷酸的反义寡核苷酸或反义硫代磷酸酯寡核苷酸序列,用脂质体等将反义寡核苷酸导入体内靶细胞,然后反义寡核苷酸与相应mRNA特异性结合,从而阻断mRNA 的翻译。

2)反义RNA表达载体:合成或PCR 扩增获取反义RNA 的DNA ,将它克隆到表达载体,然后

将表达载体用脂质体导入靶细胞, 该DNA 转录反义RNA ,反义RNA 即与相应的mRNA 特异性结合,同样阻断某基因的翻译。

反义RNA目前主要用于恶性肿瘤、病毒感染性疾病等。有报导，用反义封闭胰腺癌、肺癌的癌基因，对癌细胞具有明显的抑制作用。1.3三链DNA 脱氧寡核苷酸能与双螺旋双链DNA 专一性序列结合,形成三链DNA ,来阻止基因转录或DNA 复制,此脱氧寡核苷酸被称为三链DNA 形成脱氧寡核苷酸(TFO)。为了与作用在mRNA 翻译水平的反义RNA 的反义技术相区别,将三链DNA 技术称之为反基因技术。

基本方法与机理

设计合成15～40个碱基的脱氧寡核苷酸, 这些序列具有较短而兼并性较高的特点, 与双链DNA结合,通常结合在蛋白识别位点处,形成三链DNA ,干扰DNA与蛋白质的结合, 如转录激活因子, 从而阻止基因的转录与复制。1.4部分基因药物

生物技术的开发迅猛异常、日新月异。生物技术的核心是基因工程, 基因工程技术 最成功的是用于生物治疗的新型药物的研制。已有近50 种基因工程药物投入市场, 产生 了巨大的社会效益和经济效益。生物技术用于疾病的预防和疑难病症的治疗已经成为现 实。基因药物主要为以下几个系列：

（1）干扰素系列(IFN)IFN是一类具有广谱抗病毒活性的蛋白质，仅在同种细胞上可发挥作用。根据其来源、理化及生物学性质的不同，可分为IFN-α、IFN-β、IFN-γ 3种干扰素。干扰素具有很强的生物活性，主要表现在：

①抗病毒作用 目前慢性丙型肝炎的治疗以IFN-α为首选。②抗肿瘤作用。③免疫调节作用。

（2）白介素系列 白细胞介素是非常重要的细胞因子家族，现在得到承认的成员已达15个；它们在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用，此外它们还参与机体的多种生理及病理反应。

（3）集落刺激因子类药物(CSF)一些细胞因子可刺激不同的造血干细胞在半固体培养基中形成细胞集落，这些因子被命名为集落刺激因子，根据其作用对象，进一步命名分为粒细胞-CSF，巨噬细胞-CSF，粒细胞和巨噬细胞-CSF及多集落刺激因子。

（4）其他基因工程药物

①促进红细胞生成素 促红细胞生成素(Epo)是一种调节红细胞生成的体液因子，自从成功地克隆人类Epo基因后，其产物重组人促红细胞生成素被成功用于治疗肾性贫血及肿瘤等疾病伴发的贫血。最近的研究认为Epo是一种由缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor，HIF)家庭诱导产生的多功能细胞因子超家庭成员，对于多种器官都有保护作用。有报导，Epo能通过降低肾IRI时MDA、IL-6水平，增加SOD水平从而发挥保护作用，而最新研究还表明Epo有促进血管生成的作用。

②人生长激素人类的生长激素(Growth hormone，GH)是一条单链、非糖化、191个氨基酸合成的亲水性球蛋白，分子量21700Da，等电点pI为4.9.人生长激素具有促生长、促进蛋白质合成、对脂肪、糖、能量代谢有影响。

③人表皮生长因子 皮肤细胞表达10种以上的生长因子，它们以自分泌和旁分泌的方式对细胞自身和邻近细胞进行多种调节。

④重组链激酶 对心脑血管疾病有一定的疗效。

⑤肿瘤坏死因子 研究表明，巨噬细胞是产生TNF的主要来源。当肝、脾等网状内皮系统受到刺激后，借助于脂多糖的帮助，TNF基因开始转录，产生并释放TNF。同时B淋巴细胞也

产生一种与TNF类似的淋巴毒素，并与TNF享有共同受体。为了便于区分二者，将巨噬细胞产生的毒素称为TNF—α，淋巴细胞产生的毒素称为TNF-β。

TNF-α是迄今为止发现的抗肿瘤作用最强的细胞因子，它能特异性地直接杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞无不良影响，能抑制肿瘤细胞的增殖并促使其溶解，还可激活机体的抗肿瘤免疫反应。但是由于TNF-α能被肾快速排泄和各种蛋白酶分解作用，在体内很不稳定，半衰期很短(15～30min)，而杀伤肿瘤细胞需要12～36 h。若希望通过静脉给药获得明显的抗肿瘤效果，则必须频繁大剂量注射，进而导致严重的不良反应。目前国内外学者对其的制剂研究主要集中在高分子化学修饰和药物载体传递系统两方面．无论采取何种手段，其最终目的有二：一是减少RES的摄取，延长药物血中半衰期；二是提高药物的靶向性，降低不良反应.国外基因工程药物研究开发现状和展望

据不完全统计，欧美诸国目前已经上市的基因工程药物近100 种，还有约300 种药物正在临床试验阶段，处于研究和开发中的品种约2 000 个。近两年基因药物上市的周期明显缩短，与一般药物研究开发相比，基因工程药物研究投入较大。

美国作为基因重组技术的发源地和众多基因工程药物的第一制造者，每年在基因工程药物研究方面的投资高达数十亿美元，现已成为国际公认的现代生物技术研究和开发的“带头羊”。日本，欧洲等地也不甘落后，都根据各自的特点，制定出符合本国国情的发展战略和对策，进行着激烈的竞争和角逐，就连亚洲的韩国，新加坡等也野心勃勃地着手这方面的研究和开发。

美国：在基因工程药物的研究和开发方面美国一直保持着世界领先地位。从1971年成立第一家美国生物技术公司到现在已形成拥有1300余家公司（占全世界生物技术公司总数的2/3的令人注目的产业规模，不过短短25年的历史，到1996年8月美国有20多种基因工程药物和疫苗上市。（详见表1）另有113家美国公司的284个产品处于临床试验阶段或等待FDA批准，呈现了强劲的发展势头。

日本：日本在基因工程药品的研究和开发方面也投入了大量资金，并取得了丰硕成果。现已开发出干扰素，乙肝疫苗，人促红细胞生产素，组织纤溶酶原激活剂，人生长激素，人胰岛素，人巨噬细胞集落刺激因子，人粒细胞集落刺激因子等众多产品。国内基因工程药物研究开发现状及展望

我国生物工程药物研究虽起步较晚，基础较差，但一开始就受到党和国家的高度重视。为跟踪世界新技术革命迅猛发展的浪潮，1986年3月我国一批著名科学家倡导起草了“高技术研究计划”——“863计划”，并将现代生物技术列为“863计划”最优先发展的项目和国家“七五”，“八五”攻关项目。经过广大科技工作者的艰苦努力，已取得了鼓舞人心的进展，一批基因工程产品的上游研究正在努力展开；一些产品正逐步进入开发研究阶段，不少产品已步入临床试验阶段或已获新药证书，进入工业化生产，详见表2。

与传统制药相比，生物制药有便于大规模生产、利润高、生产工艺简单、人力投入少、无污染、生产周期短等优点，因此，随着人类基因组计划的实施和科技水平的进一步发展，基因药物在医药市场的比例也将会日益提升，也将越来越影响人类的生活。

基因药物同时具有高投入、高收益、高风险、长周期的特征。Frost&Sullivan公司的一份最新报告指出，2004年，全球生物制药市场的收入为450亿美元。到2011年，其有望达到982亿美元。据预测，全球第一个用转基因植物生产的生物药物可望于2005～2006年上市。随着公众认知度的提高和相关法规的逐步完善，用转基因植物生产生物药物的市场将飞速增长，到2011年，单美国市场就将达到22亿美元。2002年底到2003年5月间一场突如其来的SARS疫情，再加上2005禽流感病毒传播，席卷了亚洲及加拿大等地。在紧张而又严肃的应对

这场疫情的过程中，生物制药又成为医药行业人士关注的焦点。

我国生物制品需求巨大，过去的几年我国企业一直能保持年均15％以上增幅，并且近年来销售的增长速度有加快的趋势。据统计，2005年国内生物制品销售收入总额为157．4亿元人民币，销售利润总额为38.7亿元人民币。预计到2006年生物技术工业总产值将达400亿到500亿元，到2015年总产值可达1100亿到1300亿元。我国的生物制药业将进入一个快速发展的阶段,生物医药工业将成为医药产业增长最快的部分。目前,我国许多省市已将生物制药作为本地的支柱产业重点扶持。一大批生物医药科技园相继在各地高新技术开发区建成。面对入世带给我国生物制药业的挑战和机遇,专家们预测,在未来若干年,我国的生物制药业将以超过全球平均增长速度步入高速发展轨道,前景十分广阔。

参考文献

[1] 张骁，束梅英，张韬.中国药房，9（1）：977-978,1998 [2] 张天民，杨钊，谢继青,等.2000 年我国生化药物的研究进展[J].中国药学杂志，2001，36（5）：296-299.[3] 李元，陈松森，王渭川.基因工程药物[M].北京：化学工业出版社，2002,2.[4] 唐冬生，夏家辉，新型基因工程药物[J].生命科学研究，1999,3(2):93.[5] 李拥军,基因工程药物及其产业化发展[J].生产力研究,2003,3：185 [6] 孔秀英 ,孙秀杰，基因治疗，生物学杂志[J].2005,7(2):63.[7] 陈诗书，人类基因治疗研究的新进展，生物工程进展[J].1994,14(1)：30.[8] 张明徽，基因治疗的现状与展望，世界科学[J].1995，10：20-21.[9] 罗登，基因治疗新时期，生物工程进展，1994，14(4)：28-29.[10] 胡蝶，廖静．基因芯片技术在肿瘤研究中的应用[J].首都医科大学学报，2004，25(1)：1 29． [11] 张忠诚,动物乳腺生物反应器的原理及研究进展,中国奶牛,2006,4：29 [12] 安瑞生,陈晓峰，肿瘤基因治疗技术，中国肿瘤，2001，10(10):578-579.[13] P Ghezzi, M Brines,Erythropoietin as an antiapoptotic，tissue-protective cytokine[J]．Cell Death Differ，2004，11(Suppl 1)：37-44．

[14] C23 Erbayraktar S，Yilmaz O，Gokmen N，et a1．Erythropoietin is a multifunctional tissue-protective cytokine[J]．Curr Hematol Rep，2003，2(6)：465-470．

[15] Kang DH，Park EY，Yu ES，et al, Renoprotective effect of erythropoietin(EPO)：Possiblyvia an amelioration of renal hypoxia with stimulation of angiogenesis in the kidney[J]．Kidney Int.2005, 67(5):1683.[16] 人生长激素研究进展，陈蓓，朱威，生物学杂志[J].2004，21（1）：9-10

第四篇：基因工程论文（范文模版）

浅析基因工程技术的应用现状

动物医学专业

任课教师

指导教师姓名

摘要: 基因工程作为一门理论性与实践性较强的学科,其方法与技术已经渗透到现代生命科学的各个分支领域,成为生命科学的一门核心技术。基因工程包含许多独特的实验方法和技术,不仅内容丰富,涉及面广,实用性也强。基因工程是通过DNA 重组技术, 获得具有特殊生物遗传性状和功能的遗传工具生物体, 基因工程技术广泛应用于农业、医学、食品工业等。本文就基因工程的应用现状综合阐述。关键词 : 基因工程;应用现状

0.前言

基因工程技术是一项极为复杂的高新生物技术, 它利用现代遗传学与分子生物学的理论和方法, 按照人类所需, 用DNA 重组技术对生物基因组的结构和组成进行人为修饰或改造, 从而改变生物的结构和功能, 使之有效表达出人类所需要的蛋白质或人类有益的生物性状[1]。基因工程从诞生至今, 仅有30 年的历史, 然而, 无论是在基础理论研究领域, 还是在生产实际应用方面, 都已取得了惊人的成绩。首先,基因工程给生命科学自身的研究带来了深刻的变化。目前科学家已完成了多种细胞器的基因组全序列测定工作。其次, 基因工程具有广泛的应用价值, 能为工农业生产、医药卫生、环境保护开辟新途径。

1.基因工程

1.1 概念

基因工程(又称DNA 重组技术、基因重组技术), 是20 世纪70 年代初兴起的技术科学, 是用人工的方法将目的基因与载体进行DNA重组, 将DNA 重组体送入受体细胞, 使它在受体细胞内复制、转录、翻译, 获得目的基因的表达产物。这种跨越天然物种屏障, 把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力, 是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。1.2 基因工程研究内容

(1)从复杂的生物有机体基因组中, 经过酶切消化或PCR 扩增等步骤, 分离出

带有目的基因的DNA 片段。

(2)在体外, 将带有目的基因的外源DNA 片段连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上, 形成重组DNA分子。

(3)重组DNA 分子转移到适当的受体细胞, 并与之一起增殖。

(4)从大量的细胞繁殖群体中, 筛选出获得了重组DNA 分子的受体细胞克隆。(5)从这些筛选出来受体细胞克隆, 提取出已经得到扩增的目的基因, 供进一步分析研究使用。

(6)将目的基因克隆到表达载体上, 导入寄主细胞, 使之在新的遗传背景下实现功能表达, 产生出人类所需要的物质。

2.基因工程的广泛应用

2.1 在农业上的应用

2.1.1 抗除草剂的植物基因工程

资料表明, 每年杂草造成的经济损失占农作物总产值的10%-20%左右尽管除草剂的使用, 对大规模机械化耕作, 减少劳力开支和提高量有极为重要的作用, 但一般除草剂的选择性较差, 即除了杀草以外, 还会将作物杀死。现在利用生物技术, 将能抵抗除草剂的基因转移到植物中, 获得抗除草剂的植物, 如美国的孟山都公司将除草剂草甘磷的靶酶(EPSPS)的cDNA 克隆转入油菜[2] , 目前, 已获得的抗除草剂作物有大豆、棉花、玉米、水稻和甜菜等20 多种。2.1.2 抗虫的植物基因工程

生物防治害虫的工作已经开展多年, 主要是利用苏云金杆菌中的毒蛋白(结晶蛋白)对害虫有毒害作用, 使用这些杆菌来控制害虫。现在, 人们可以通过克隆这些毒蛋白的基因(Bt 基因)并把这些基因转移到植物细胞中, 从而获得能抗虫的转基因植物。目前, Bt 基因已被转入烟草、番茄、马铃薯、水稻、玉米及棉花等多种植物中。1996 年转Bt 基因棉花在美国种植66 万hm2 经中国农科院棉花所引进在华北试种两年, 在多点表现突出, 在完全不喷杀虫剂的情况下, 单产仍然高于喷撒2-3 次杀虫剂的中国推广棉花[3] , 显示出了控制棉铃虫的极好前景。2.1.3 动物转基因育种

动物基因工程研究主要集中在改良家畜、家禽的经济性状和通过转基因动物进行药物或蛋白质的生产等方面, 目前已取得了显著的成就, 先后培育出转基因猪、羊、牛和鱼等, 另一种转基因猪是带有人体基因的猪, 这种转基因猪客望能解决人体移植动物器官的遗体排斥问题。随着动物基因工程技术的逐渐成熟和转人体血红蛋白的基因猪、转人体血清蛋白的基因山羊等的问世, 不仅能生产出大量人类所需的血红蛋白、白蛋白等药物而且为动物育种开辟了一条全新的途径。

2.2 在医学上的应用 2.2.1 基因工程药物

利用基因工程技术开发新型治疗药物是当前最活跃和发展最快的领域。自1982 年世界第一个基因工程药物---重组胰岛素投放市场以来, 基因工程药物就成为制药行业的一支奇兵, 每年平均有3-4 个新药或疫苗问世, 开发成功的约50 个药品, 诸如人胰岛素、忍尿激酶、人生长激素、干扰素、激活剂、乙肝疫苗等广泛应用于治疗癌症、肝炎、发育不良、糖尿病和一些遗传病上, 在很多领域特别是疑难病症上, 起

到了传统化学药物难以达到的作用[4, 5, 6]。为治愈癌症正在研制的用单克隆抗体制成的“生物导弹”, 就是按照人类的设计, 把“生物导弹”发射出去, 精确的命中癌细胞, 并炸死癌细胞, 而不伤害健康的细胞, 比如专门用于肿瘤的“肿瘤基因导弹”等。可见, 生物工程药物将成为21世纪药业的支柱。而脱氧核糖核酸或者基因疫苗的问世, 变革了机体的免疫方式。如今, 人们翘首关注困扰人类的艾滋病病毒疫苗的早日问世。

尽管目前诱变育种技术仍是改良微生物工业生产菌种的主要手段,但是基因工程技术在改良工业生产菌种方面已有成功的报道。最常见的是将控制药物合成关键步骤的酶基因克隆,通过适当的载体转移到原生产菌中,以使控制限速步骤的酶水平,从而提高产量。Malmberg等[7]构建了一种带有编码赖氨酸ε-氨基转移酶基因(lysine-ε-aminotranster-ase,LAT)这种控制Streptomyces clavuligerus生物合成头霉素C的限速步骤的关键酶的基因(lat)的高拷贝质粒,并转入这种头霉素产生菌,使LAT提高活力提高了4倍,在2 L发酵罐中产生头霉素的能力是原来的2倍,重组菌胞外LAT产物α-氨基己二酸的积累量也比原受体

菌高。伊维菌素(ivermectins)是一个市场很大的抗虫

抗生素,其前体阿弗米丁(avermectins)的产生菌种的发酵液中有8个以上的组分,其中只有B1a组分才是制备伊维菌素的原料。Ikeda等[8]经过近十年的努力,已将阿弗米丁的生物合成基因簇全部搞清,并经过诱变与DNA重组,获得了仅产阿弗米丁B2a单一组分和B1a、B2a组份的重组工程菌,这不仅大大提高了阿弗米丁有效组分的发酵效价,且给提取、精制、半合成等后处理工序带来了很大的便利。可以预见,随着对各种工业生产的微生物药物生物合成途径的深入了解以及基因重组技术的不断进展,应用基因工程方法定向构建高产菌株的成功实例将越来越多。在抗生素发酵过程中供氧往往是一个限制因素,充足的氧气供给是药物工业发酵稳定和提高产量,降低成本的关键。传统的解决方法如增加通气量等对设备要求高,能量消耗大。20世70年代末在专性好氧菌透明颤(Vitreoscilla)中发现了血红蛋白(VHb),它能促进氧气扩散到细胞末端氧化酶上。于是人们想到了将其基因Vgb克隆到其它微生物中,以促进微生物在低氧条件下生长。

1988年Khosla等[9]从Vitreoscilla中分离出Vgb基因并将之转入大肠杆菌(E·coli),提高了大肠杆菌在溶氧量低于5%时对氧的利用率。目前已用克隆表达VHb的方法提高了放线紫红素、头孢霉素C、红霉素等产生菌及青霉素酰化酶基因工程菌的产量[10]。血红蛋白基因工程的研究和应用,必将对抗生素工业和其它重组药物发酵工业的节能等带来美好的前景。作为半合成头孢菌素类抗生素重要原料的7-氨基头孢烷酸（7-ACA),目前国内外仍以化学裂解头孢菌素C的工艺路线为主。国内外已报道可用经由GL-7-ACA的二步法(化学/酶法或二步酶法)来生产7-ACA,与化学裂解法相比不仅收率提高,且能大大减少环境污染,简化生产工艺。但二步法中关键的GL-7-ACA酰化酶在假单胞菌中表达量低而且分离纯化困难,限制了这种方法的应用。通过将GL-7-ACA酰化酶基因转入大肠杆菌中表达恰好可以解决这一问题[11]。最近又报道可将编码2个酶的基因直接转入头孢菌素C的生产菌种中,使其在发酵时直接产生7-ACA。调节基因在药物的生物合成中也起着重要作用,增加调节基因的基因量能够大幅提高药物产量。Hopwood等将放线紫红素生物合成的一个调节基因actⅡ导入原产生菌,尽管基因的拷贝数仅增加了2倍,放线紫红素的产量却增加了30~40倍。某些抗生素生产菌的产量不高,是由于其自

身对该抗生素的抗性不高。因此,利用高拷贝质粒的基因量效应,增加菌种对自身产生的抗生素的抗性,可能增加抗生素的产量。例如,将氨基糖苷-6-乙酰转移酶基因导入卡那霉素和新霉素产生菌,由于提高了对氨糖类抗生素的抗性,产量提高了2~6倍 2.2.2 基因治疗

基因治疗是指由于某种基因缺陷引起的遗传病通过转基因技术而得到纠正。临床实践已经表明: 基因治病已经变革了整个医学的预防和治疗领域。比如白痴病, 用健康的基因更换或者矫正患者的有缺损的基因, 就有可能根治这种疾病。现在已知的人类遗传病约有4000种, 包括单基因缺陷和多基因的综合症。运用基因工程技术或基因打靶的手段, 将病毒的基因杀灭, 插入矫正基因, 得以治疗、校正和预防遗传疾病的目的。目前, 基因治疗已扩大到肿瘤、心血管系统疾病、神经系统疾病等的治疗[12]。人类也已成功实现了肾、心、肝、胰、肺等器官的移植, 也有双器官和多器官的联合移植。

基因治疗有两种途径: 一是体细胞的基因治疗, 一是生殖细胞的基因治疗。由于生殖细胞的基因治疗操作技术异常复杂, 又涉及伦理缓行之理充足, 故尚无人涉足[13]。基因工程是20 世纪生命科学中最伟大的成绩, 开辟了生命科学的新纪元。经过几十年的发展, 基因工程技术已成为一个巨大的朝阳产业, 它可以超越动物、植物、微生物之间的界限, 创造出新的生物类型。基因工程不仅在医学上应用广泛, 而且也广泛应用在工业、农业、冶金、环保、资源、能源、畜牧渔业等领域, 为人类的丰衣足食和健康长寿提供了持续的实用价值很高的产品, 发展前景极为广阔。

参考文献：

[1] 陈渝军, 林晶.基因工程技术在医药卫生领域的应用及发展.药品评价,2005, 2(2): 144-145.[2] 童克中.基因及其表达.北京: 科学出版社, 2001.[3] 李尉民, 乐宁, 夏红民.转基因生物及其产品的风险与管理.生物技术通报.2000(4)41-44.[4] 朱宝泉.基因工程技术在医学工业中的应用及进展[ J].中国医药工业志.1997.28(2): 56-58.[5] 方鹏.基因工程应用简述[ J].辽宁师专学报.2004.6(2): 29-30.[6] 周黎, 柯传奎.基因工程药物研究现状与对策[ J].生命科学仪器2004.1: 22.[7] Malmberg LH, Hu WS, Sherman DH·Journal of Bacteriology,1993, 175(11): 6916~6924· [8] Haruo Ikeda, SatoshiOmura·Journal ofAntibiotics, 1995, 48(7):549~562· [9] Chaitan Khosla, JamesEB·Nature, 1988, 331: 633~635·

[10] 郭宏秋,杨胜利·微生物学通报, 1996, 23(4): 227~230· [11] 周煜,刘涤,胡之璧·药物生物技术, 2000, 7(4): 251~253·

[12] 路正兵, 夏颖.基因工程在疾病防治及药物研制上的应用[ J].安徽预防医学杂志.2000.6(5): 398-400.[13] 王俊杰21 世纪基因工程在肿瘤防治中的应用[ J] 2000.6(6):62-67.分子生物学

—谈基因工程技术如何应用于植物

摘要：通过基因工程改良品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。尽管科学家们对转基因植物的争论仍在继续，但可以肯定的是，转基因植物作为一项新兴的生物技术的产物，在解决日益膨胀的地球人吃饭问题和在解决长期困惑人类发展的资源短缺、环境恶化、经济衰退三大难题中起着越来越重要的作用。本文综述了基因工程技术在植物中的应用，就转基因植物的技术、发展、安全性和发展前景作了探讨。

关键词：基因工程技术；转基因植物；安全性；发展前景

所谓转基因植物是指利用基因工程技术，在离体条件下对不同生物的DNA进行加工，并按照人们的意愿和适当的载体重新组合，再将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞内表达的植物。自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速，成功的转基因植物已达60多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例。

1植物的转基因技术

由于植物的体细胞具有全能性，即单个的细胞经过合适培养后可以生成完整的植株。将分离能够编码所需产物的DNA片段克隆到适当的载体DNA中形成重组DNA，利用细菌繁殖扩增重组DNA并将重组DNA中的目的基因导入所需的培育的植物细胞中，筛选出所需要的细胞，通过细胞的全能性将转基因植株大规

模种植。

其中外源基因导入植物细胞的方法可分为DNA直接转化和以载体为媒介的基因转化。基因的直接转移是通过物理化学法将外源基因转入受体植物细胞的技术。常用的方法有化学刺激法、脂质体法、显微注射法和基因枪法等。其原理是利用物理化学方法暂时改变膜通透性，使DNA进入细胞，并最终整合到植物基因组中。

以载体为媒介的基因转化即使通过农杆菌或植物病毒介导感染受体植物将外源基因转入植物细胞的技术。目前，载体法主要包括土壤农杆菌Ti质粒、Ri质粒及植物DNA病毒等介导的遗传转化法。

2转基因植物的筛选与检测

通过转基因的方法将目的基因转入目的植物的细胞后，转化细胞与非转化细胞相比都只占少数，两者存在竞争，而转化细胞的竞争力通常比非转化细胞弱，因此必须对转化细胞进行筛选和检测。

在构建重组DNA时，人们已经引入了标记基因以对转化子选择和鉴定。报告基因由于其表达产物易于检测，已广泛用于转基因植物中。根据报告基因编码特点，大致分为两类：抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因或发光基因。根据检测的不同阶段区分，有DNA检测法、RNA检测法及蛋白质检测法。DNA检测法只能检测到外源基因是否已经整合到植物基因组中，而RNA检测法得到的结果可判定外源基因是否转录，蛋白质检测法则可检测出外源基因是否翻译。

3改进转基因的技术

随着植物转基因技术的创立和发展，许多具有重要经济价值的农作物获得了转基因植株，植物转基因技术成为植物育种的一个重要手段，但仍有许多问题阻碍了转基因技术在生产上的广泛的应用。将外源DNA导入植物细胞后，只有外源DNA在宿主细胞及其子代细胞中稳定整合和有效的表达，才能培育出具有新的遗传性状的转基因植物。大量研究表明外源基因在转基因植物中有的能正常表达，有的表达量很低，甚至不表达，而且在不同的植株个体之间也存在着明显差异。所以提高转基因的表达，减少转基因的失活是转基因技术的一个重要内容。提高外源基因表达水平的措施有: 3.1农杆菌介导的遗传转化方法由于其产生的拷贝数相对较少，可以在一定程度上避免这个问题。

3.2使用信号肽，每种植物蛋白质的作用空间位置都是不同的，蛋白质分子的定向运输需要特殊多肽信号的引导作用。3.3选择强启动子和诱导型启动子

3.4使用强终止子 常用的终止子时CaMV35S终止子和根瘤土壤杆菌T-DNA的胭脂氨基酸合成酶基因的nos终止子。

3.5消除甲基化的影响 在载体上加上去甲基化功能的序列以防止甲基化。3.6使用植物偏爱的密码子 3.7使用MAR序列 3.8使用增强子

3.9对外源基因进行修饰和改造 3.10以叶绿体作为转化受体 3.11使用一些病毒编码蛋白

3.12在有性生殖后代中筛选单拷贝植株

4基因工程在农作物上的应用

4.1抗虫转基因作物

最早获得的转Bt（苏云金杆菌）毒素基因植物是烟草和番茄，随后Bt毒素基因相继被转化到许多其他农作物中，如棉花、水稻、玉米等，获得了一大批具良好抗虫性的转基因植物品种。4.2抗病毒作物

植物病毒感染时一个严重的问题，它可导致农作物生长缓慢、产量降低和质量减退。转基因植物的成功使作物抗病毒成为可能并加速了作物抗病育种的研究进程。自1986年Powel-Abel首次将烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白（Cp）基因导入烟草，培育出抗TMV植株以来，已经将许多 病毒成功的构建了多种抗病毒植株，近几年的研究结果表明病毒外壳蛋白在系统杂交保护中起着重要的作用，插入一段已克隆的CP基因可以延缓病毒的发展和阻止病毒在转基因植株中进一步传播。

4.3抗细菌和真菌作物

细菌和真菌病在全部植物病害中造成的损失最大，很多科学家都在尝试从植物的生物体内寻找抗病原菌的蛋白及其基因，并将其用于植物基因工程。自1980年，瑞典科学家首次从美国惜古比天蚕种成功分离了3种诱导型的杀菌肽进行了深入的研究。它们对很多种植物病原菌有较强的杀伤作用。现在的实验结果表明，杀菌肽作用于细胞的细胞膜，破坏膜的完整性，造成离子通道，最终导致细胞内含物泄露。目前，杀菌肽基因工程已经在烟草、马铃薯等植物上有了初步报道。

4.4抗除草剂转基因作物

人类自有农业起就一直跟杂草作斗争，它是农业生产中的大敌，但由于它具有较强的生态适应性和抗逆性，所以给杂草的防治带来了困难。在大量使用化学除草剂的同时往往会对作物造成一定的伤害。为此人们在研究抗除草剂基因，将该基因转入植物，在喷施除草剂杀死杂草时，不伤害作物。20世纪80年代中期，抗除草剂基因被转入了作物体内，从而获得了抗除草剂的转基因大豆、棉花、玉米、油菜、小麦等。

4.5抗非生物胁迫作物

干旱时困扰农业生产的重要因素之一，它给农业生产带来巨大的损失，这种损失甚至是毁灭性的。CMO基因是合成乙酰-甜菜碱第一步反应关键酶的基因，具有很强的抗旱性。Rathinasabathi等奖烟草中的CMO基因导入水稻中，获得抗旱性较强的转基因水稻。可以相信在未来培育出的耐旱的新作物品种应该是转入多种共同作用的外源基因。

5转基因植物的安全性

..5．1转基因植物的优缺点 关于转基因植物及其安全性问题，是近年来的热 门话题，但目前国际上没有统一说法，争论不一。其主要优点：①增加食物供应，解决粮食短缺；②减少农药使用，避免环境污染；③降低生产成本，降低食物售价；④增加食物营养，提高附加价值；⑤增加食物种类，提升食物品质；⑥提高生产效率，带动相关产业发展。其主要缺点：①可能对蝴蝶等昆虫造成伤害； ②可能影响周边植物的生长；③可能使昆虫或病菌在演化中增加抵抗力或产生新的物种，因此有可能会伤害作物。..5．2转基因食品的安全性和可接受性

随着转基因技术的发展，转基因食品的安全性越来越受到人们的关注。转基因食品与传统食品相比，区别在于：首先它含有利用转基因技术导人的外源基因；其次可能存在外源基因在受体内的表达产物。由于这两种成分的不确定性以及由

此引起的次级效应，对人类健康可能有潜在的危害。目前人t fx转基因食品生物的担忧基本上可以归纳为3类：(1)转基因食品里加入的新基因无意中对消费者造成的健康危害；(2)转基因作物中的新基因对食物链其他环节无意中造成的不良后果；(3)人为强化转基因作物的生存竞争性，对自然界生物多样性的影响。其中人们最为担心的是转基因食品对人体健康是否安全，转基因食品与常规食品比较有无不安全的成分。这就需要对其主要营养成分、微量营养成分、抗营养因子的变化、有无毒性物质、有无过敏性蛋白以及转入基因的稳定性和插入突变进行检测。另外是人们对..“基因逃逸”的担心。所谓..“基因逃逸”，就是指微生物之间可以通过转导、转化、接合进行基因转移。人们主要是担心转基因作物及基因食品的有害基因是否会逃逸到人体或环境中，加快抗药性问题。如野生植物种通过受粉可能会完成抗除草剂的基因改良，会变成..“超级杂草”，由此形成的具有非自然抗逆性的植物对那些以其为生的动物们来说，可能会导致生物链的断裂。

6转基因植物的发展前景

转基因植物在人类发展史上，是人类对自然的认识和改造的结果，必将对人类的生存带来重大影响。随着人们对遗传本质认识的深化和生物技术水平的不断提高，大量的转基因植物不断涌现。通过转基因技术来改良作物的品质是一个不可阻挡的趋势，因为现在有许多问题是无法通过常规育种来解决的，特别是耐旱、耐贫瘠等作物品种的培育。例如非洲的沙漠地区，如果按照现在的育种手段，它的粮食产量根本不可能满足基本生活保证，人们现在 寄希望于通过转基因技术生产一些比较耐旱、耐贫瘠的作物，以解决因为土地可耕面积的减少而给人类带来的压力。另外，转基因技术可以改良作物的营养成分，现在非常知名的一个例子就是瑞士联邦技术研究所成功开发的金色大米，它是通过将胡萝卜素合成途径的关键基因转到水稻中去，生产出的大米是金黄色的，这种水稻含有VA的合成原料，在解决吃饭问题的同时有助于治疗因缺乏VA而导致的眼睛失明等疾病，这对于发展中国家非常重要。因此转基因技术具有广阔的发展前景。但是，在大力发展转基因食品的同时，应建立完善的转基因产品评价和监控体系。1 993年，世界经济合作与开发组织发表了..“现代生物技术食品的安全评价——概念和原则”，提出了..“质量等同性概念”，其含义是..“当某个由转基因技术生产的新食品的各项主要特征(分子学特征、遗传形状、主要营养成分等)与现有食品大致相同，则认为该新食品的安全性也与现有食品大体等同。”我国政府也于1 993年、1 996年和2 001年分别颁布了有关条例和规定，要求对转基因食品的试验、生产、应用等实行生产许可证和经营许可证制度，同时对违规试验、生产、应用、进出口转基因食品的机构和人员，规定了严厉的处罚措施。但如何维护消费者的知情权，对转基因食品实行标志制，如何加强对进口转基因食品的检验监管，保证我国的食品卫生安全等尚需进一步完善，加强研究。

综上所述，基因工程技术作为一项新兴的生物技术，其发展趋势不可阻挡。但科学技术是把双刃剑的理论同样适合转基因植物。为此，我们应该适当借鉴国外经验，建立一套既符合中国国情，又与国际接轨，且科学合理的基因安全评价和监控体系，为日后我国转基因植物走向世界奠定基础。

参考文献：

（1）李立家

肖庚富

基因工程

科学出版社 2010.8

（2）李书国，陈辉，庄玉亭．基因工程在食品工业中的应用．粮油与油脂，2001.2（3）夏焕章

熊宗贵 生物技术制药

高等教育出版社 2010.3（4）谈家桢．基因工程．北京：农业出版社，1979．..基因工程抗体研究进展及其临床应用

摘要：基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体，近年来随着生物工程技术的发展，许多基因工程抗体陆续问世，本文详细介绍了基因工程抗体的研究进展，概述了基因工程抗体在临床方面的明显优势和应用潜力。关键词：基因工程抗体；研究进展；临床引用

Advances in Genetic Engineering Research and Clinical

Application of Antibody

Student majoring in Professional Veterinary Medicine Name DongChuanJun

Tutor Name MinLingJiang

Abstract:Genetic engineering antibody is the third generation antibody after polyclonal antibody and monoclonal antibody.In recent years,with the development of bio-engineering techniques,many genetically engineered antibodies have been presented to the public,and this article elaborates on research progress of the genetic engineering antibody,and its obvious advantages and potentials in clinical application.Key words: Genetically engineered antibodies;Research;Clinical application.转基因技术迅速发展，其应用和发展的领域日益夸大。但转基因技术的弊端日益凸现，引起众多关注的目光。就转基因技术本身而言，社会各界对它的态度各有异同。不同的国家不同的民族和不同的个体对转基因技术的态度大相径庭。如何看待转基因技术？如何去应用和发展转基因技术？这些都是我们亟待解决的问题。基因工程抗体介绍

1.1 基因工程简介

基因工程抗体是借助DNA重组和蛋白质工程技术，在基因水平对免疫球蛋白分子进行切割、拼接、修饰和重新组装的一种新型抗体。所制备的抗体去除或减少了可引起副作用的无关结构，但保留天然抗体的特异性和主要生物学活性，并可赋予抗体分子以新的生物学活性的总称【1】。

由于目前制备的抗体均为鼠源性临床应用时，对人是异种抗原，重复注射可使人产生抗鼠抗体，从而减弱或失去疗效，并增加了超敏反应的发生，因此，在 80 年代早期，人们开始利用基因工程制备抗体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能[2]。目前多采用人抗体的部分氨基酸序列代替某些鼠源性抗体的序列，经修饰制备基因工程抗体，称为第三代抗体[3]。1.2 基因工程抗体种类

基因工程抗体主要包括嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体等。

1.2.1 嵌合抗体

嵌合抗体（chimeric atibody）是最早制备成功的基因工程抗体。它是由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子【4】。因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。

1.2.2 人源性抗体

是将人抗体的CDR代之以鼠源性单克隆抗体的CDR，由此形成的抗体，鼠源性只占极少，称为人源化抗体。

1.2.3 完全人源化抗体

采用基因敲除术将小鼠Ig基因敲除，代之以人Ig基因，然后用Ag免疫小鼠，再经杂交瘤技术即可产生大量完全人源化抗体。

1.2.4 单链抗体

是将Ig的H链和L链的V区基因相连，转染大肠杆菌表达的抗体分子，又称单链FV（single chain fragment of variable region,sFv）。SFv穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。

1.2.5 双特异性抗体

将识别效应细胞的抗体和识别靶细胞的抗体联结在一起，制成双功能性抗体，称为双特异性抗体。如由识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞（CTL细胞、NK细胞、LAK细胞）表面分子的抗体（CD3抗体或CD16抗体）制成的双特异性抗体，有利于免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用。基因工程抗体的研究进展

2.1抗体工程的发展

最近，美FD强调：目前在临床试验中基因工程抗体约占生物制剂的30%。重组抗体的体积越来越小，或被重新构建成多价分子，或与其它分子相融合，如放射性核素、毒素、酶、脂质体和病毒的药剂设计成为可能。

【5】

。重组技术的出现使筛选、人源化、抗体的生产得到革新，并取代杂交瘤技术，从而使以抗体为基础

图1：抗体的发展

2.2目前基因工程抗体制备的主要方法 2.2.1人鼠嵌合抗体

主要是利用基因重组技术，把鼠抗体的重轻链可变区部分与人抗体重轻链恒定区的进行重组，减少鼠源结构，增加人源结构，而保持抗体与原抗原的特异性结合【6】。

1.首先把小鼠编码Ig重轻链的基因剔除。2.制备表达人的Ig重轻链的转基因小鼠。

3.上二种小鼠回交，获得只表达人Ig重轻链的基因的小鼠。当用抗原免疫后，小鼠可产生完全人源抗体。2.2.2 噬菌体抗体库技术

1.人的Ig重轻链可变区基因片段展示在噬菌体表面,组成抗体库。2.过噬菌体把抗体的表型和基因型相偶联，易进行分子克隆和基因操作。3.抗体库的来源影响筛选结果（免疫和正常人）。4.高通量筛选与抗原结合的抗体，但亲和力低。2.2.3 用人的骨髓瘤细胞直接制备全人抗体

由于骨髓瘤细胞稳定性高和融合率高，所以要建立好的人骨髓瘤细胞。2.2.4 B细胞永生化技术

用EB病毒将人淋巴细胞永生化可产生分泌抗体的B细胞克隆【7】。这一技术较为成熟，但是存在抗体分泌不稳定的缺点，限制了其应用。或直接分离分泌抗体的B细胞,用PCR获得重轻连,构建全人抗体。2.3抗体药物发展现状

1.FDA已批准上市的抗体药物。

2.SFDA(中国)已批准上市及临床研究的的抗体药物。2.4工程抗体的未来发展与展望 2.4.1单克隆抗体的市场需求

图2：单抗体市场的预测与分析 3.基因工程抗体药物的应用

随着生物工程技术的发展，许多基因工程抗体 陆续问世，并在医学领域的许多方面都具应用潜力，如病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病、同种异体移植物注射、哮喘、中风和青光眼治疗，尤其在诊断和治疗肿瘤性疾病及抗感染方面优势明显。

3.1基因工程抗体药物的临床应用

3.1.1 在肿瘤性疾病诊疗方面的应用

放射性标记抗体在肿瘤影像和治疗中很重要，并可有效进行药代动力学评估．以标记抗体注入人体内显示肿瘤部位抗原与抗体结合的放射浓集称放射免疫显像，由于基因工程抗体如单链抗体、Fab片段等分子量小、能很快清除、组织穿透力强，所以更适于放射免疫显像【8】。

恶性肿瘤的导向治疗，是通过重组技术将抗肿瘤相关抗原的抗体与多种分子

融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能．这些分子包括：放射性核素、细胞毒药物、毒素、小肽、蛋白、酶和用于基因治疗的病毒．对肿瘤治疗来说，设计的双特异性抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞毒物质输送到肿瘤细胞．此外，抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEG偶联，从而增强体内运输和药代动力学。作为免疫脂质体，转铁蛋白受体抗体可使药物通过血脑屏障到达大脑．抗体酶复合物作为前体药物也被用于基础肿瘤治疗。3.1.2基因工程抗体的抗感染作用

预防和治疗感染性疾病常用的药物是疫苗和抗生素，但对于一些尚无有效预防及治疗手段的感染性疾病如 SARS、AIDS等，抗体治疗可做为首选方案。如在治疗AIDS方面，利用抗体工程技术已成 功地制备出HIV病毒整合菌的单链抗体ScAb2219，对HIV病毒感染的早期和晚期具有有效的抑制作用，并可望成为S基因治疗的有效手段。呼吸道合胞病毒(RSV)易引起婴儿呼吸道疾病，如细支气管炎和肺炎，并可引起严重的并发症，目前已有人源化单克隆抗体Palivizumab经美国FDA批准上市，临床实验证明无毒、副反应，并可显著降低婴儿的住院率。我国率先建立了针对SARS的基因工程抗体库，这对于 SARS的预防、诊断和治疗都将起到重要作用和深远影响。对于中和其它病原分子，FDA已批准 Fab单体分子作为抗蛇毒药物；scFv片段和寡克隆复合物作为抗细菌毒素药物。3.1.3 细胞内抗体

随着细胞信号转导和抗体工程技术的发展，诞生了细胞内抗体技术。这项技术是指在细胞内表达并被定位于亚细胞区室如胞核、胞浆或某些细胞器，与特定的靶分子作用从而发挥生物学功能的一类新的工程抗体。最典型的是 scFv，被称为内抗体。胞内抗体技术主要应用在抑制病毒复制特别是 HIV-1复制、肿瘤基因治疗方面，现已逐渐拓展到中枢神经系统疾病、移植排斥和自身免疫性疾病等领域。体外培养来源于无关供体的角质形成细胞同种移植物用于严重的烧伤病人的治疗，往往会引起排斥反应，而MHCI类分子是引起移植排斥的重要抗原。Mhashikar等用编码抗 MHC I单链抗体的腺病毒转染角质形成细胞，结果显示明显降低了MHCI的表达，细胞内抗体介导的表型敲除是否有利于同种移植物的存活还需要进一步研究。

3.1.4 用于未来诊断的生物传感器和微矩阵技术

生物传感器和微阵列技术在不久以后将有可能成为主要的体外诊断技术．对于大量诊断试剂盒，抗体有高敏感性和高特异性．从最初的玻璃界面到现在的多种蛋白亲和界面，用于诊断的抗体微矩阵界面不断发展．随着体外机械人的出现，这一技术将进一步发展，并用于微生物污染、寄生虫和生物病原体的检测。

3.2基因工程抗体药物的应用领域

1.肿瘤导向治疗；

2.哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、急性心梗、脓毒症、多发性硬化症及其他自身免疫性疾病； 3.心脑血管疾病； 4.感染性疾病； 5.“生物导弹”

4.基因工程技术的发展方向

针对基因工程抗体药物的应用，明确基因工程技术的发展方向，从而让基因工程抗体对我们更有利[9]。

1.开发针对神经系统、肿瘤、心血管系统、艾滋病及免疫缺陷等重大疾病的多肽、蛋白质和核酸等新生物技术产品；

2.选择一批市场前景好的生物技术产品及疫苗、诊断用单克隆抗体，开发重点是乙肝基因疫苗与单克隆抗体诊断试剂等；

3.开发靶向药物主要是开发抗肿瘤药物。目前治疗肿瘤药物确实存在一个所谓“敌我不分”的问题。在杀死癌细胞的同时，也杀死正常细胞。导向治疗就是针对这个问题提出来。所谓导向治疗就是利用抗体寻找靶标，如导弹的导航器，把药物准确引入病灶，而不伤及其他组织和细胞；

4.人源化的单克隆抗体的研究开发。抗体可以对抗各种病原体，亦可作为导向器，但目前的单克隆抗体，多为鼠源抗体，其本身也被异种生物体视为抗原，当被注入人体后会诱导产生抗体或激发免疫反应。目前国外已研究噬菌体抗体技术，嵌合抗体技术，基因工程抗体技术以解决人源化抗体问题；

5.血液替代品的研究与开发仍然占重要地位。血液制品是采用大批混合的人体血浆制成的，由于人血难免被各种病原体所污染，如艾滋病病毒及乙肝病毒等，通过输血而使接受输血的人感染艾滋病或乙型肝炎的案例时有发生，因此利用基因工程开发血液替代品引人注目。

基因工程抗体的进展已使抗体制备技术进入了一个全新时代，尤其药物抗体库的进展，解决了人源抗体的研制，促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发，可以预见基因工程抗体的研制正在进入一个新的高峰。但是抗体的亲和力减弱，与完整抗体结构相比，功能明显就会降低。人们对可能出现的新组合、新性状会不会影响人类健康和环境，还缺乏知识和经验，按目前的科学水平还不能完全精确的预测。所以我们要在抓住机遇，大力发展基因工程技术的同时，需要严格管理，充分重视转基因抗体的安全性

【10】。

致谢：非常感谢闵令江老师在我大学的学习阶段教给自己基因工程这门学科。我从中学到了很多知识，认识了关于基因工程方面的一些问题，使自己从一无所知到现在基本认识了这门学科，在此我向老师表示我诚挚的谢意，感谢老师的诚

挚教导。

【参考文献】

[1]楼士林，杨盛昌，龙敏南，等。基因工程[M]。北京：科学出版社，2002。

[2]李庆军，董艳桐，施冰。植物抗虫基因的研究进展[J]。林业科技，2002，27(2)：22 26。[3]Avivi I，Robinson S，Goldstone A．C1 inical use of rituximab in haematologica1 ma1ignancies[J]．Br．J．Cancer 2003，89：1389-1394．

[4]Cai X．，et a1．Proc．Nat1[J]．Acad．Sci．，USA 1995，92：6537-6541．

[5]Schi1lberg S．，Fischer R．，Emans N。Molecular farming of recombinant ant [6ibodies in plants[J]．Cel 1 Mo1．Life Sci．2003，60：433-445． ]Bouquin T．，Thomsen M．，Nie1sen L．K．，et a 1．Human ant i— rhesus D IgG1 ant ibody produced in transgenic plants[J]．Transgenic Res．2002，11：115-122．

[7]Wi seman G．A．，Leigh B．，ErwinW．D．，et a1． Radiation dosimetry results for Zevalin radioimmunotherapy of ritux。imab。refractory non—Hodgkin lymphoma．Cancer 2002，94：1 349—1 357． [8]沈孝宇。转基因之争[M]。北京:化学工业出版社,2008。

[9] 李彪;鼠－人嵌合抗体的研制及应用[J];国外医学。放射医学核医学分册;1996年04期。[10] 黄华梁;基因工程抗体的研究[J];中国肿瘤生物治疗杂志。

基因工程在现代社会中的应用与前景

在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，按照人类的需要进行设计，然后按设计方案创建出具有某种新的性状的生物新品系，并能使之稳定地遗传给后代，这就是基因工程。

基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，即“目的基因”。被称为“分子剪刀”的“限制性转切酶”可以在DNA分子上找到特定的“切点”，然后将认准的双链交错切断。自70年代以来，人们已找到400多种形形色色的“分子剪刀”。二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组 DNA。在用同一种“分子剪刀”剪切的两种DNA碎片中加上“分子针线”——“DNA连接酶”，就可以把两种DNA片段重新连接起来。三是把重组DNA引入某种细胞。把“拼接”好的DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种分子小、能自

由进出细胞，而且在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒，因为质粒能自由进出细菌细胞。四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。目的基因的导入过程是肉眼看不到的。因此，要知道导入是否成功，事先应找到特定的标志。例如我们用一种经过改造的抗四环素质粒PSC100作载体，将一种基因移入自身无抗性的大肠杆菌时，如果基因移入后大肠杆菌不能被四环素杀死，就说明转入获得成功了。

科学家曾预言，21世纪是基因工程的世纪。基因工程对人类来说，作用是不可估量的，意义是深远的。

随着人类对基因研究的不断深入，发现许多疾病是由于基因结构与功能发生改变所引起的。科学家将不仅能发现有缺陷的基因，而且还能掌握如何进行对基因诊断、修复、治疗和预防，这是生物技术发展的前沿。这项成果将给人类的健康和生活带来不可估量的利益。

所谓基因治疗是指用基因工程的技术方法，将正常的基因转如病患者的细胞中，以代病变基因，从而表达所缺乏的产物，或者通过关闭或降低异常表达的基因等途径，达到治疗某些遗传病的目的。目前，已发现的遗传病有6500多种，其中由单基因缺陷引起的就有约3000多种。因此，遗传病是基因治疗的主要对象。

基因治疗的最新进展是即将用基因枪技术于基因治疗。其方法是将特定的DNA用改进的基因枪技术导入小鼠的肌肉、肝脏、脾、肠道和皮肤获得成功的表达。这一成功预示着人们未来可能利用基因枪传送药物到人体内的特定部位，以取代传统的接种疫苗，并用基因枪技术来治疗遗传病。

目前，科学家们正在研究的是胎儿基因疗法。如果现在的实验疗效得到进一步确证的话，就有可能将胎儿基因疗法扩大到其它遗传病，以防止出生患遗传病症的新生儿，从而从根本上提高后代的健康水平。

加快农作物新品种的培育

科学家们在利用基因工程技术改良农作物方面已取得重大进展，一场新的绿色革命近在眼前。这场新的绿色革命的一个显著特点就是生物技术、农业、食品和医药行业将融合到一起。

基因技术的突破使科学家们得以用传统育种专家难以想象的方式改良农作物。例如，基因技术可以使农作物自己释放出杀虫剂，可以使农作物种植在旱地或盐碱地上，或者生产出营养更丰富的食品。科学家们还在开发可以生产出能够防病的疫苗和食品的农作物。

基因技术也使开发农作物新品种的时间大为缩短。利用传统的育种方法，需要七、八年时间才能培育出一个新的植物品种，基因工程技术使研究人员可以将任何一种基因注入到一种植物中，从而培育出一种全新的农作物品种，时间则缩短一半。

基因工程自20世纪70年代兴起之后，经过二十多年的发展历程，取得了惊人的成绩，基因治疗

特别是近十年来，基因工程的发展更是突飞猛进。基因转移、基因扩增等技术的应用不仅使生命科学的研究发生了前所未有的变化，而且在实际应用领域——医药卫生、农牧业、食品工业、环境保护等方面也展示出美好的应用前景。

基因工程与医药卫生

目前，基因工程在医药卫生领域的应用非常广泛，主要包括以下方面： 1.基因工程药品的生产：

许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。

微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。⑴基因工程胰岛素

胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。

将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%!⑵基因工程干扰素

干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。

基因工程人干扰素α-2b（安达芬）是我国第一个全国产化基因工程人干扰素α-2b，具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。⑶其它基因工程药物

人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。基因工程药品是制药工业上的重大突破。

目前用基因诊断方法已经能够检测出肠道病毒、单纯疱疹病毒等许多种病毒。

基因工程与农牧业、食品工业

基因工程在农牧业生产上的应用主要是培育高产、优质或具有特殊用途的动植物新品种。基因工程在农业方面的应用主要表现在两个方面。首先，是通过基因工程技术获得高产、稳产和具有优良品质的农作物。例如，用基因工程的方法可以改善粮食作物的蛋白质含量。其次，是用基因工程的方法培育出具有各种抗逆性的作物新品种。自然界中细菌的种类是非常多的，在细菌身上几乎可以找到植物所需要的各种抗性，如抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗盐碱、抗干旱、抗高温等。如果将这些抗性基因转移到作物体内，将从根本上改变作物的特性。

基因工程在畜牧养殖业上的应用也具有广阔的前景，科学家将某些特定基因与病毒DNA构成重组DNA，然后通过感染或显微注射技术①将重组DNA转移到动物受精卵中。由这种受精 卵发育成的动物可以获得人们所需要的各种优良品质，如具有抗病能力、高产仔率、高产奶率和高质量的皮毛等。

在工业上，由于用微生物进行发酵生产要比在大田中进行农牧业生产具有许多优越性，因而它已成为农牧业发展的一个远景方向。而要实现这一目标，基因工程将是最有效的手段。例如，有人设想并正在试验将抗生素生产菌放线菌或霉菌的有关遗传基因转移至发酵时间更短、更易于培养的细菌细胞中；将动物或人产胰岛素的遗传基因转移至酵母或细菌的细胞中；将家蚕产丝蛋白的基因引入细菌细胞中；把人或动物产抗体、干扰素、激素或白细胞介素（interleukin）等的基因转移至细菌细胞中；把不同病毒的表面抗原基因转移到细菌细胞中以生产各种疫苗；用基因工程手段提高各种氨基酸发酵菌的产量；构建分解纤维素或木质素以生产重

要

代

谢

产

物的工

程

菌；

基因工程还可以为人类开辟新的食物来源。

基因工程与环境保护

基因工程的方法可以用于环境监测基因工程还可以用于被污染环境的净化。造成环境污染的农药，并试图通过基因工程的方法回收和利用工业废物。凡此种种，都是一些可望取得成功和发展前景十分光明的研究课题。

例如，目前用100000克胰脏只能提取3～4g胰岛素，而用“工程菌”进行发酵生产，则只要用几升发酵液就可取得同样数量的产品。1978年，美国有两个实验室合作，使E．coli产生大白鼠胰岛素的研究已获成功。接着，又报道了通过基因工程使E．coli合成人胰岛素实验成功的消息。他们在实验室中曾将人胰岛素A、B两链的人工合成基因分别组合到E．coli的不同质粒上，然后再转移至菌体内。这种重组质粒可在E．coli细胞内进行正常的复制和表达，从而使带有A、B链基因的“工程菌”菌株分别产生人胰岛素的A、B链，然后再用人为 的方法，在体外通过二硫键使这两条链连接成有活性的人胰岛素。另外，在1977年，国外已利用基因工程技术，使E．coli生产出一种名为生长激素释放因子“SRIH”的动物激素（一种十四肽，能抑制其他激素的释放和治疗糖尿病等），它原来要从羊的脑下垂体中提取，宰50万头羊也只能提取5mg的产品，而现在只要用10L发酵液就可获得同样的产量。近年来，应用遗传工程获得这类产品的例子正与日俱增，尤其是多肽类物质，如脑啡肽（大脑中的镇痛物质）、卵清蛋白（即“OV”，389肽）、干扰素（用于治疗病毒性感染）、胸腺素α-1（有免疫援助因子的作用，可治疗癌症）、乙型肝炎疫苗和口蹄疫病毒疫苗等。我国学者也急起直追，在脑啡肽、α-干扰素、γ-干扰素、人生长激素、乙型肝炎疫苗、含乙肝表面抗原基因的牛痘病毒株以及青霉素酰化酶等的基因工程研究中，取得了一系列令人鼓舞的成果。

（2）基因工程在农业上的应用基因工程在农业上应用的领域也十分广阔。有人估计，到本世纪末，每年上市的植物基因工程产品的价值，相当于医药产品的十倍。几个主要的应用领域包括：①将固氮菌的固氮基因转移到生长在重要作物的根际微生物或致瘤微生物中去，或是干脆将它引入到这类作物的细胞中，以获得能独立固氮的新型作物品种。根据估算，利用前一方法，其研究经费仅及通过常规方法发展氮肥工业以达到同样效果的二百分之一至二千分之一；而后一途径则更省事，其成本还不到上述的二千分之一；②将木质素分解酶的基因或纤维素分解酶的基因重组到酵母菌内，使酵母菌能充分利用稻草、木屑等地球上贮量极大并可永续利用的廉价原料来直接生产酒精，并可望为人类开辟一个取之不尽的新能源和化工原料来源；③改良和培育农作物和家畜、家禽新品种，包括提高光合作用效率以及各种抗性基因工程（植物的抗盐、抗旱、抗病基因以及鱼的抗冻蛋白基因）等。

基因工程的前景

从70年代起逐步建立起来的基因工程技术，使基因或一些具有特殊功能的DNA片段的分离变得十分容易。这些基因或特殊DNA片段的一级结构（即它们的核苷酸序列）的测定也是十分容易的，由基因的核苷酸序列去推测蛋白质的氨基酸残基的序列也变得轻易而举。利用计算机技术可以很容易的对推测出来的蛋白质进行高级结构的分析，可以对来自不同生物种类的基因序列进行同源性分析。所有这些方法或技术的广泛使用，不仅大大地推动了分子生物学的迅猛发展，而且也大大推动了生命科学各个分支领域的迅速发展。因此，基因工程技术的第一个重要应用领域就是大大的推动了科学理论研究的发展。

由于基因工程是从遗传物质基础上对原有的生物（常常称之为受体生物）进行改造，经过改造的生物就会按照研究者的意愿获得某种（些）新的基因，从而使该生物获得某些新的

遗传性状。这种性状可以用人的肉眼直接观察到，也可能是通过某些反应或仪器间接观察到。这种受体生物可能是微生物，植物或动物，因而它会涉及到许多生产行业。

基因工程技术几乎涉及到人类的生存所必需的各个行业。比如将一个具有杀虫效果的基因转移到棉花、水稻等农作物种中，这些转基因作物就有了抗虫能力，因此基因工程被应用到农业领域；要是把抗虫基因转移到杨树、松树等树木中，基因工程就被应用到林业领域；要是把生物激素基因转移到支物中去，这就与渔业和畜牧业有关了；如果利用微生物或动物细胞来生产多肽药物，那么基因工程就可以应用到医学领域。总之一句话，基因工程应用范围将是十分广泛的

第五篇：基因工程论文

学号：13054107

基因工程结课论文

靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体构建

院（系）名

称： 理学院 专业

名

称： 生物科学 学

生

姓名： 姜己玉 所

在班

级： 13-1

目录

摘要............................................................................................................................................2 第一章 绪论..............................................................3 1..1RNAi的研究进展....................................................3 1.1.1RNAi的分子作用机制...........................................3 1.1.2 RNAi 的特点..................................................3 1.1.3 siRNA简介.........................................................3 1.1.4 s iRNA 的设计原则..........................................3 1.2 用于 RNA i 的载体....................................................4 1.2.1 载体的选择..................................................4 1.2.2 质粒人工构建的目的.................................................4 1.3 MRP1 的研究进展......................................................4 第二章 实验材料与方法.....................................................5 2.1 实验材料.............................................................5 2.1.1 宿主菌.............................................................5 2.1.3 载体通用引物................................................5 2.1.5 主要仪器..........................................................5 2.2 试验方法.........................................................5 2.2.1 shRNA 的设计与退火..................................................5 2.2.2 合成干涉片段的退火..........................................6 2.2.3 重组载体的构建..............................................6 2.2.4 菌落PCR初步筛选阳性重组子..................................7 2.2.5 测序鉴定重组载体...............................................7 第三章 结果与分析.........................................................8 3.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后胶回收结果...........................8 3.1.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后结果.............................8 3.1.2 目的片段的回收................................................8 3.2 重组质粒的菌落PCR...................................................8 3.3 重组质粒大量提取......................................................8 3.4 重组质粒测序结果.................................................8 参考文献..................................................................9

摘 要

癌症严重威胁着人类的健康，其发病率呈上升趋势。化疗作为其常规临床治疗手段，在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替代的作用。肿瘤细胞的多药耐药性（multidrug resistance, MDR）是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂，多药耐药相关蛋白1（Multidrug Resistance-associated Protein 1，MRP1）的过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的能快速、高效、特异的沉默目的基因表达的技术，如能通过RNAi技术沉默MDR1基因，逆转肿瘤细胞的多药耐药性将为改善癌症病人的化疗效果奠定基础。

目的：本课题选用pRNAT-H1.1/shuttle-RFP表达穿梭载体。构建针对mrp1 mRNA的RNA干扰表达载体。

方法：将预先根据MRP1基因序列设计合成的编码siRNA的cDNA序列与pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒载体连接，构建靶向mrp1 siRNA重组质粒。将重组质粒转化E.coli DH5α后大量提取重组质粒，经菌落 PCR和 DNA测序分析检测重组载体构建结果。

结果：成功构建靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体。为下一步抑制mrp1基因在肿瘤细胞中的表达奠定基础。

关键词：RNA干扰；MRP1；pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒；穿梭载体

第1章 绪 论

1.1 RNAi的研究进展

RNA干扰(RNA interference , RNAi)是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程，为一种双链RNA分子在mRNA 水平上关闭相关基因表达的过程，是一项新兴的基因阻断技术。RNAi有望成为分析人类基因组功能的有力工具，在肿瘤病因、免疫机制及治疗等方面的研究上有广阔的发展前景。

1.1.1 RNAi的分子作用机制

RNAi的作用机制在众多学者的努力研究下日渐明朗。不同生物体内的RNA干扰作用机制也各有不同，但是主要可以分为两种类型：特异效应作用机制与非特异效应作用机制。特异性效应一般发生在短双链RNA（21～23nt）上，非特异性效应发生于长双链RNA（30nt以上）。

1.1.2 RNAi的特点

RNAi具有高效性，也就是说与细胞内的mRNA的量相比，注入细胞内的siRNA的量要少得多。但由于循环放大机制的存在，仍可以有效地阻断目的基因的表达；同时，RNAi也具有高特异性，小干扰RNA由dsRNA降解得到的，除在序列识别中不起主要作用的正义链3′端的两个碱基以外，其余碱基均为必需。

1.1.3 siRNA简介

RNA干扰作用是通过siRNA（small interfering RNA，siRNA）这类小RNA分子作为较稳定的中间介质实现的。通过对植物的研究证明，双链RNA复合体降解为35nt左右的小RNA分子后通过序列互补与mRNA结合，进而降解mRNA。

1.1.4 siRNA的设计原则

RNAi 作用的成功与否，关键在于siRNA序列的结构，不同结构的siRNA序列沉默基因的效率差别很大，2001年，Elbashir S M等[应用化学合成法合成了siRNA，并发现可以诱导哺乳动物发生RNAi，他们进而据此提出了siRNA 设计方法：1)从起始密码下游50~100nt开始搜索siRNA以避免出现于5′或3′端的UTRs 的蛋白结合位点，；

2)搜索5′AA(N19)UU序列，如果没有相应序列，可以选择5′AA(N21)或5′NA(N21)；3)G/C含量在32%~79%之间[16]； 4)要确定siRNA对靶基因的特异性，可以利用Blast软件在基因组中进行比对，；5)设置在基因组中无对应序列的siRNA的对照siRNA。但是，Elbashir S M等的设计方法siRNA 筛选效率仍然很低，要更好的掌握RNAi。

1.2 用于RNAi的载体

基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具，称为载体。是指能够运载外源DNA片段进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。载体具有以下的功能：（1）运送外源基因高效转入受体细胞；（2）为外源基因提供复制能力或整合能力；（3）为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。

1.2.1载体的选择

质粒是为一种1-200kb不等的双链、闭环的DNA分子。是染色体外稳定遗传，并能以超螺旋状态存在于宿主细胞中的因子。RNA干扰实验通常选用质粒作为载体。质粒载体是为适应实验室操作在天然质粒的基础上人工构建的。但是，天然质粒的缺点是分子量大，拷贝数低，所以为使分子量尽可能减少，必须去掉大部分的非必需序列，以便于基因工程操作。

1.2.2 质粒人工构建的目的

天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建

1.3 MRP1的研究进展

MRP1的底物 直接通过细胞毒性分析和底物刺激的ATP酶测量进行识别MRP1的底物的，底物是由大量的多样化的疏水复合物，有机阴离子结合物以及阴离子非结合性底物所组成。典型的结合型底物包括：谷胱甘肽，葡糖醛酸和硫酸盐结合物，MRP1的组织分布 MRP1在体内的表达可以说是无所不在。

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 宿主菌

E.coli DH5α：为感受态宿主菌由北京鼎国生物技术有限责任公司提供。

2.1.2 质粒载体

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒。pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒特性如下：pRNAT-H1.1/shuttle 是一种腺病毒siRNA穿梭质粒，shRNA的表达由人的转录启动子H1 Promoter启动，H1启动子属于PolⅢ启动子，该启动子总在其下游的固定距离开始转录合成RNA，转录过程遇到4~5个连续的U即终止，非常精确；同时CMV Promoter为真核生物启动子，可在该质粒中高效启动红色荧光蛋白的表达；MCS为多克隆位点。

2.1.3 载体通用引物

正向引物（M13）：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ 反向引物（Rev）：5′-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3′

2.1.4 主要试剂、具酶及仪器

质粒快速提取试剂盒，Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒，10×PCR buffer，dNTP，Marker(1kb,100bp)，Goldview DNA染料，EDTA Bio Basic Inc 溶菌酶，LiCl Amresco RNase Sigma bacto-typtone Bio Basic Inc bacto-yeast extract Bio Basic Inc PEG8000，HindⅢ NEB，BamHI NEB，T4DNA连接酶 NEB，Taq酶，微量振荡器（MM-2型），微量振荡器（MM-2型），恒温空气摇床，电子天平，紫外分析仪（ZF型），低温离心机（SK18），低温离心机（SK18），PCR仪（9600型），ABI 恒温磁力搅拌器（2003-16），恒温水浴锅，自动双重纯水仪

2.2 实验方法

2.2.1 shRNA的设计与退火

根据siRNA设计原则[34]，根据MRP1靶序列，设计合成四对互补反向重复脱氧核糖核酸序列，中间间隔9nt茎环序列(TTCAAGAGA)，5′端带有BamHⅠ酶切位点，3′端带有HindⅢ酶切位点，用BLAST进行同源性分析，确定与其他基因无同源性。shRNA的 5

DNA模板由上海生工合成，单链干涉片段退火后形成双链。根据2个靶序列设计的2对DNA干涉片段mrp1-1，mrp1-2。

2.2.2 合成干涉片段的退火

合成片段的退火体系：各管混匀后90℃保温3分钟，37℃保温1h，再取5μL退火溶液加45μL 灭菌双蒸水混匀，使干涉片段终浓度为8ng/μL。

2.2.3 重组载体的构建

（1）将含有pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒的大肠杆菌接种入盛有200mL LB培养基（含2μg/mL氨苄青霉素）的500mL三角瓶中，置37℃振荡培养过夜（置摇床中160r/min）。（2）实验前预先配制溶液Ⅱ，溶菌酶。预冷溶菌酶、溶液Ⅰ和溶液Ⅲ。取出菌悬液，观察菌体生长状况，将菌悬液分装于两个250ml离心桶中，调平。预冷离心机至4℃，4℃下8000r/min离心5min，弃上清，得菌体。（3）加预冷的溶液Ⅰ50ml于每离心桶，混匀，洗涤沉淀。8000r/min离心5min，弃上清，得沉淀。此步骤的目的为出去培养基，以获得更纯的细菌沉淀物。（4）用17ml溶液Ⅰ吹散重悬细菌沉淀物，加3ml新配制的溶菌酶溶液，温和混匀，室温放置10min，裂解大肠杆菌。（5）加40ml新配制的溶液Ⅱ，以使菌体破碎，释放质粒DNA等内容物。缓慢颠倒数次，防止破坏基因组DNA，室温放置3min。（6）加30ml预冷的溶液Ⅲ，缓慢颠倒数次，防止SDS破坏基因组DNA，冰浴放置15min。4℃下以10000r/min离心10min，然后将上清液全部倒入新离心桶中。（7）将上清液在4℃下以10000r/min离心10min，然后将上清液经8层纱布过滤至新离心桶中。（8）加0.6倍体积（约54ml）的异丙醇，充分混匀，室温放置15min，以沉淀核酸。8000r/min离心15min，小心倒掉上清，敞开瓶口倒置于纸巾上，使残余上清液流尽，晾干。（9）加15ml水再加15ml LiCl（预冷）混匀，静置沉淀15min，4℃下10000r/min离心15min，以出去蛋白质和RNA。（10）倒上清于新的离心桶中，加30ml异丙醇，剧烈震荡，静置沉淀15min，在4℃下以10000r/min离心15min。再次沉淀核酸。（11）弃上清，得到沉淀的核酸。敞开瓶口倒置于纸巾上使残余上清液流尽。（12）用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下以10000r/min离心5min，弃去乙醇，离心桶敞口倒置于纸巾上，使乙醇挥发殆尽。此步骤可以沉淀DNA。（13）加2ml无菌水溶解沉淀，将液体吸到10ml离心管中，再吸2ml ddH2O冲洗瓶壁，随后将洗液加到同一10ml离心管中，随后加100µl RNaseA，37℃，水浴30min。以使RNA彻底分解。（14）加等体积含13％（w/v）聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于4℃以12000转/分，离心15分钟，以回收质粒DNA。（15）沉淀用3ml70%乙醇重悬清洗，以除去PEG，12000r/min离心8min。（16）重复上步操作，将离心管倒扣于纸巾上10min，加1ml H2O溶解，用等体积酚/氯仿/异戊醇再抽提一次蛋白质，室温下8000r/miin离心10min。（17）小心吸上清与另一离心管中，加2倍体积的预冷无水乙醇，再加0.1体积的NaAC（3mol，pH5.2），冰上沉淀20min，4℃下10000r/min离心15min，使DNA沉淀出来。（18）去上清加入3ml 70%乙醇重悬清洗，10000r/min 离心15min，晾干，用500µl无菌水溶解沉淀。

2.2.4菌落PCR初步筛选阳性重组子

灭菌牙签挑取LB筛选平板上圆滑单菌落，先在预先分隔并标记的另一LB平皿上划板，然后点入制备好的PCR反应混合液，开始扩增。PCR反应条件为：94℃预变性2分钟；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸45s，共35个循环；72℃ 延伸1分钟，4℃保存，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。划板的平皿于37℃培养12-16h。

2.2.5 测序鉴定重组载体

将小提鉴定结果正确的质粒送交上海生工生物工程技术服务有限司，以载体反向引物为测序引物。将经鉴定后未发生突变的H1.1-

1、H1.1-2靶向MRP1基因siRNA重组质粒的宿主菌摇瓶扩大培养后，进行质粒大量提取,方法如2.1.2.3.1所述。

第3章 结果与分析

3.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后胶回收结果

3.1.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后结果

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒经HindⅢ和BamHI双酶切，结果显示单酶切产物大小约为6200bp，双酶切产物略小于单酶切产物，与预期结果相符。

3.1.2 目的片段的回收

目的片段回收 ,结果显示回收产物大小约为6Kb，与预期结果相符。

3.2 重组载体的菌落PCR 重组载体菌落 PCR电泳，结果显示PCR扩增产物,电泳分析发现阳性产物可以扩增出560bp大小的条带，假阳性产物不能扩增出560bp大小的条带,与预期结果相符，可以初步筛选出阳性产物。

3.3 重组质粒大量提取

重组质粒大量提取后的电泳，结果显示pRNAT-H1.1/shuttle-RFP 重组质粒大小约为6.2kb，与预期结果相符。

重组质粒大提并稀释50倍以后在紫外分光光度仪Genespec上测其OD值。

3.4 重组质粒测序结果

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒测序鉴定，结果显示重组质粒的碱基序列与预期结果一致，未发生碱基突变，说明pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒构建成功。

参考文献

[1] 张淑华.小干扰RNA靶向VEGF基因在体内外抑制乳腺癌细胞增殖的研究[D].青岛:青岛大学硕士，2007.[2] Sharp PA.RNA interference-2001.Genes Dev.2001, 15: 485-490.[3] 康洁, 刘福林.RNAi的抗病毒作用及其机制[J].现代免疫学, 2004, 24(5): 439-441.[4] 林少微,王雪华,郑高哲等.RNAi的研究进展 [J].中国医药导报, 2007, 4(29)_3.[5] 黄艳敏,贾欣秒.RNA干扰技术的研究进展 [J].河北化工, 2009, 32(1):213-216.[6] 邓庆.E2F8及肿瘤-睾丸(CT)基因在肝癌中作用的研究[D].上海交通大学硕士.2009.[7] 赖长城.人类Pin1在食管癌组织中的表达[D].福建:厦门大学硕士.2008.[8] 魏群，分子生物学实验指导（第二版）[Q]2007,11:3.[9] 陈爱葵,李梅红.RNAi的研究及应用 [J].广东教育学院学报, 2008, 28(3):5.[10] 王光海.MRP1与肺癌耐药.临床肺科杂志[J].2005,5，（3）：367.