食用油中苯并（a）芘的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201910）

附件10

食用油中苯并（a）芘的快速检测

胶体金免疫层析法

(KJ201910)

范围

本方法规定了食用油中苯并（a）芘的胶体金免疫层析快速检测方法。

本方法适用于食用油中苯并（a）芘的快速测定。

原理

本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的苯并（a）芘经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中苯并（a）芘进行定性判定。

试剂和材料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T

6682规定的二级水。

3.1

试剂

3.1.1

正己烷：色谱纯。

3.1.2

乙腈：色谱纯。

3.1.3

二甲基亚砜（DMSO）。

3.1.4

NaH2PO4•2H2O。

3.1.5

Na2HPO4•12H2O。

3.1.6

氯化钠。

3.1.7

吐温-20。

3.1.8

氢氧化钠溶液（2

mol/L）：称取80g氢氧化钠用水溶解，并定容至1L。

3.1.9

PBST溶液：称取0.2965

g

NaH2PO4•2H2O、2.9

g

Na2HPO4•12H2O、8.76

g氯化钠与0.55

g吐温-20用水溶解并定容至1

L。

3.2

参考物质

苯并（a）芘参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度均≥95%。

表1

苯并（a）芘参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子质量

苯并（a）芘

Benzo(a)pyrene

50-32-8

C20H12

252.32

注：或等同可溯源物质。

3.3

标准溶液的配制

苯并（a）芘标准储备液（0.1 mg/mL）：精密称取适量苯并（a）芘标准品（3.2），置于10

mL容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.1 mg/mL的苯并（a）芘标准储备液；或可直接购买苯并（a）芘标准储备液。0

℃~5

℃避光保存备用，有效期1年。

3.4

材料

苯并（a）芘胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为食用油。

3.4.1金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）。

3.4.2

试纸条或检测卡。

仪器和设备

4.1

移液器：100

µL、1

mL、5

mL和10

mL。

4.2

涡旋混合器。

4.3

离心机：转速≥4000

r/min。

4.4

电子天平：感量为0.01

g。

4.5

氮吹仪或空气吹干仪（带温度控制）。

分析步骤

5.1

试样制备

取适量有代表性样品充分混匀。

5.2

试样提取和净化除脂

称取10

g油样于离心管中，加入5

mL

正己烷（3.1.1）和15

mL

DMSO（3.1.3）并混合均匀。漩涡振荡2min，然后4000

r/min离心2

min。弃去上层正己烷层。加入5

mL

正己烷（3.1.1），漩涡振荡30

s，然后4000

r/min离心30

s。弃去上层正己烷层。加入10

mL

氢氧化钠溶液（2

mol/L）（3.1.8）和15

mL正己烷（3.1.1），漩涡振荡30s，然后4000

r/min离心30

s。吸取上层正己烷层于15

mL离心管，4000

r/min离心2

min。取全部正己烷层于氮吹管中，50℃氮吹或空气吹10

min，吹干后加入200μL

DMSO（3.1.3）复溶，混合均匀，此为待测液。

5.3

测定步骤

打开试纸筒，取出所需数量的红色反应微孔（取出微孔后，立即盖好桶盖，以防受潮）。往微孔中加入200

μL的PBST溶液，再加入50

μL待测液，上下抽吸5~10次至微孔试剂混合均匀，室温（20℃~25℃）反应7

min。将已做好标记的试纸条插入至上述红色微孔中，使样品垫充分进

入样品中，并计时7

min。从微孔中取出试纸条，弃去试纸条下端的样品垫，进行结果判定。

5.4

质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

5.4.1

空白试验

称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。

5.4.2

加标质控试验

准确称取空白试样（精确至0.01

g）置于玻璃试剂瓶中，加入一定体积的苯并（a）芘标准储备液（0.1

mg/mL）（3.3.1），使试样中苯并（a）芘浓度为10

μg/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。

结果判定方式

由于长时间放置会引起质控线（C线）与检测线（T线）颜色的变化，需在规定时间内进行结果判定。试纸条与检测卡如图1所示。结果判定也可根据产品说明书进行。

6.1

读数仪测定结果

通过读数仪对结果进行判读，根据不同厂家仪器规定进行判读。

无效：质控线（C线）不显色，无论检测线（T线）是否显色，均表示实验结果无效。

阳性：若检测结果显示“+”（阳性），表示试样中含有待测组分且其含量大于等于方法检出限。

阴性：若检测结果显示“-”（阴性），表示试样中不含待测组分或其含量低于方法检出限。

6.2

目视判定

通过对比质控线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。

无效：质控线（C线）不显色，无论检测线（T线）是否显色，均表示实验结果无效。

阳性：质控线（C线）显色，若检测线（T线）不出现或出现但颜色浅于质控线（C线），表示试样中含有待测组分且其含量高于方法检出限，判为阳性。

阴性：质控线（C线）显色，若检测线（T线）颜色深于或等于质控线（C线），表示试样中不含待测组分或其含量低于方法检出限，判为阴性。

6.3

质控实验要求

空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。

C

T

S

C

S

T

C

T

S

C

T

S

C

T

S

C

T

S

加样孔

无效

阴性

阳性

B．检测卡

吸水纸

NC膜

样品垫

无效

阴性

阳性

C线

T线

A．试纸条

图1目视判定示意图

结论

当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。

性能指标

8.1

检测限

10μg/kg。

8.2

灵敏度

≥95%。

8.3

特异性

≥85%。

8.4

假阴性率

≤5%。

8.5

假阳性率

≤15%。

注：性能指标计算方法参见附录A。

其他

本方法分析步骤和结果判定可以根据厂家试剂盒的说明书进行，但应符合或优于本方法规定的性能指标。

本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。

本方法参比标准为GB

5009.27-2016《食品安全国家标准

食品中苯并（a）芘的测定》。

本方法使用试剂盒可能与苯并（a）蒽、苯并（b）荧蒽、苯并（e）芘、苯并（j）荧蒽等物质存在交叉反应，当结果判定为阳性时应对结果进行确证。

附录A

定性方法性能计算表

表A.1性能指标计算方法

样品情况a

检测结果b

总数

阳性

阴性

阳性

N11

N12

N1.=N11+N12

阴性

N21

N22

N2.=N21+N22

总数

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

显著性差异（χ2）

χ2=（|N12-N21|-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1

灵敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特异性（p-，%）

p-=N22/N2.假阴性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-灵敏度

假阳性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特异性

相对准确度，%c

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：

a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果。

b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。

N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。

本方法负责起草单位：广东省食品检验所。

验证单位：成都市食品药品检验研究院、中国农业科学院油料作物研究所。

本方法主要起草人：熊含鸿、王立亚、简德威、陈思敏、雷毅