第一篇：质粒DNA提取定量酶切与PCR鉴定实验报告
粒 质粒 DNA 的提取、定量、酶切与 PCR 判定 一、实验目的 1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA 的要领； 2.学习并掌握了解质粒酶切判定的要领； 3.学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度和纯度的原理和要领； 4.学习并掌握 PCR 基因扩增的实验原理和操纵要领； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用要领。
二、实验原理 1.PCR(多聚酶链式反响)
在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步调，在体外（缓冲液中）复制 DNA，使目的 DNA 按 2 n 方法呈指数形式扩增。
PCR 一次循环的具体反响步调为：
A.变性：加热反响系统至 95℃，使模板 DNA 在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐低落溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板 Tm 值的 5℃左右），与模板 DNA 互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反响温度升至中温 72℃，在 Taq 酶作用下，以 dNTP 为原料，引物为复制起点，模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒 DNA 的提取与制备(1).碱裂解法：
染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差别：
A.高碱性条件下，染色体 DNA 和质粒 DNA 均变性；
B.当以高盐缓冲液调治其 pH 值至中性时，变性的质粒 DNA 复性并生存在溶液中，染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：
A.硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中的质粒 DNA，而不吸附溶液中的卵白质和多糖等物质； B.通已往卵白液和漂洗液将杂质和其它细菌身分去除； C.低盐，高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。
3.质粒 DNA 的定量阐发（紫外分光光度法）：
A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性； B.种种差别的物质都具有其各自的吸收光谱: DNA 分对波长 260nm 的紫外光有特异的吸收峰 卵白质对波长 280nm 的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰 C.A260/A280 及 A260/A230 的比值可以反响 DNA 的纯度； A260/A280=1.8
DNA 纯净 A260/A280<1.8
体现样品中含卵白质（芳香族）或酚类物质
A260/A280>1.8
含 RNA 杂质，用 RNA 酶去除。
4.质粒 DNA 的酶切判定：
限制性内切酶是 DNA 重组操纵历程中所使用的根本东西。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊 DNA 序列结合，或是与其四周的特异位点结合，并在结合位点切割双链 DNA。
5.琼脂糖凝胶电泳：
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的巨细决定于琼脂糖的浓度。
DNA 分子在碱性情况中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：差别的 DNA，分子量巨细及构型差别，电泳时的泳动率就差别，从而分出差别的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比干系).三、质料与要领：
：
（一）实验质料：
：
1.PCR 仪器：PCR 仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管 质料：菌液【大肠杆菌 DH5a 菌株(pMD19-T 质粒,含目的片段-绿色荧光卵白 GFP)】、无菌去离子水、2×Premix Taq、引物 2.质粒 DNA 的提取与制备 仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf 管、微量加样枪、离心管 质料：溶液 P1（S1）、溶液 P2(S2）、溶液 P3（S3）、去卵白液 PE（W1）漂洗液WB（W2）、洗脱液 EB（Eluent)、含 pMD19-T 质粒的大肠杆菌 DH5α 3.质粒 DNA 的定量（紫外分光光度法）
仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪 质料：蒸馏水、质粒ＤＮＡ 4.质粒 DNA 的酶切判定 仪器：1.5ml 的 EP 管、微量加样枪 质料：无菌水、10×M 酶切缓冲液 Buf R、质粒 DNA、Hind III(15U/ul)、EcoR I(12U/ul)5.琼脂糖凝胶电泳
仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统 质料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液（二）实验要领
1..PCR..质粒 DNA 的提取与制备
准备目的 DNA：菌液煮沸 10min，冷冻，室温解冻后离心取上清液 取 0.2 ml PCR 反响管一只，用微量加样枪按下述顺序分别参加：灭菌去离子水5.5μl、2*Premix Taq12.5μl、引物 1(10 mol/L)1μl、引物 2(10 mol/L)1μl、菌液 5μl 将装有 PCR 反响体系的 PCR 反响管放入 PCR 仪上进行如下操纵：
①94℃预变性5分钟后开始以下循环 ②循环为94℃——30 秒，50℃——30 秒，72℃ ——1 分钟。循环为 30 次 ③72℃ 5 分钟 ④4 ℃
保温 取 1.5ml 培养物参加 Eppendorf 管中 将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中
13000rpm x 1min，弃上清
将 PCR 反响管置台式离心机中瞬时离心
3.质粒 DNA 的定量（紫外分光光度法）
参加 250μl 溶液 S1，吹打，使细菌沉淀疏散，彻底悬浮
参加 250μl 溶液 S2，颠倒 4～6 次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮
参加 350μl 溶液 S3，立即温和混匀 6~8 次。13000rpm 离心 10min，小心取上清液（500-800μl）
将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液参加吸附柱中，13000rpm 离心 3min，弃滤液
参加 500μl 去卵白液(W1)，13000rpm 离心 1min，弃滤液
向吸附柱中参加 700μl 漂洗液 W2，13000rpm 离心 1min，弃滤液；重复一遍 空柱 13000rpm 离心 1min，然后室温安排 3min，使残留乙醇挥发 取出吸附柱，放入一个洁净的离心管中，在吸附膜的中间加 50μl 洗脱缓冲液(Eluent)，室温安排 1min，13000rpm 离心 1min 洗脱质粒 DNA，-20℃生存备用 清洗比色皿：用微量加样枪向比色皿参加适量的蒸馏水刷洗，2~3 次。并用滤纸擦拭洁净 空白比较比色测定 向比色皿参加 98ul 蒸馏水，进行 Blank 调零 再向比色皿参加 2ul 的质粒 DNA，于紫外分光光度计上进行‘sample’测定，记录相关数据
4..质粒 DNA 的酶切判定
5.琼脂糖凝胶电泳
四、结果与讨论 ：
（一）实验现象 1.参加溶液 P1，出现悬表现象； 2.参加溶液 P2,温和混匀，溶液会变得清亮； 在一个洁净的 1.5mlEP 管中按顺序依次参加下述试剂
无菌水 9.0μl、10×M 酶切缓冲液 2.0μl、质粒 DNA 7.0μl、Hind III(15U/ul)1.0μl、EcoR I(12U/ul)
1.0μl 小心混匀试剂，将 EP 管置于恒温水浴箱中 37℃1.5 小时。
取质粒 DNA、经酶切反响后的 DNA 片段和 PCR扩增的 DNA 各 6μl 于三个 EP 管中并做好标记 往每个 EP 管中参加 1μlGelview 染料，室温安排一分钟 用微量加样枪分别各吸取 10ul，按序号参加到电泳仪的凝胶孔中 电泳 30 分钟
取出凝胶 紫外光下视察，拍照
3.参加溶液 P3,有白色絮状沉淀生成； 4.电泳时，可视察到在电流作用下，点样的溶液出现电泳现象，电泳速度差别。
在紫外检测仪条件下，可以视察到差别的物质出现差别的电泳带。
（二）实验结果
原始实验数据 丈量次数
质粒 DNA 浓度（ug/ml）
Ratio 比值(A260/A280)
148
1.46
1.52
115
1.45平均值
123
1.47
电泳后的图片
A:PCR 目的条带
B:酶切片段
C:质粒 DNA
（四）实验阐发 1.由上数据可知，Ratio=1.47
A260/A280<1.8
表明样品中含有较多的卵白质（芳香族）
2.在图片中，其他三类 DNA 与 Maker 相比力，可知质粒 DNA 的分子巨细在 2500bp-3500bp，酶切反响的质粒 DNA 片段分子巨细在 2800-3000bp 和 400-500 左右，PCR 的 DNA 分子巨细在 400-500bp。根本切合预期。
（四）实验讨论 1.质粒 DNA 中出现三条带，分别对应超螺旋质粒 DNA、线性 DNA 和开环状质粒 DNA。这三种差别构型的分子有差别的迁移率，在一般情况下，迁移速度最快的为超螺旋型，其次为线性分子，最慢的为开环状分子，所以条带从上到下分别为：超螺旋型 DNA、线性分子、开环状分子。, 2.对付实验结果中：A260/A280<1.8 的可能原因为：
A.在质粒 DNA 的提取实验的“取上清液”步调中吸入沉淀导致引入较多的卵白杂质，进而导致后续实验中因卵白质量较多而难以去除。
B.可能为试剂污染引起杂质卵白的引入。
3.实验中需注意的事项：
用微量加样枪加试剂时，同种试剂可以不消换吸头，每次换差别试剂时要记得换一个新吸头。
在 PCR 中，如果配好的反响液较多沾到管壁上，要将 PCR 反响管置台式离心机中瞬时离心，使反响液会合于管底，然后才将反响管放到基因扩增仪上。
在质粒 DNA 提取的实验中，参加溶液 S2 时，时间不能太久，行动要温柔，轻轻颠倒频频。
在电泳实验中，点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡。
在电泳中，Geldview 有毒，切勿用手打仗。
思考题：
（1）碱裂解法提取质粒时，溶液 I、II、III 的作用分别为？ 答：
溶液 I：螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对 DNA 的降解作用；有利于溶酶体的作用。
溶液 II：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和卵白质变性。
溶液 III：酸性条件下质粒 DNA 复性，变性卵白-SDS+线性 DNA 沉淀，Na+可中和 DNA。
（2）结合实验情况，如何提高限制性酶切的反响效率？ 答：
①尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。
②酶量的选择任何时候 2 种酶的总量不能凌驾反响体系的 1/10 体积，并且最大反响体系最好不要小于 20 ul，且酶切反响中甘油浓度应低于 5%。
③底物 DNA 的纯度：主要污染 DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反响应尽量纯化底物。
④反响系统：主要是反响缓冲液中的离子强度,如 NaCl 和 Mg2+, 符合离子强度可以引发酶切反响。
第二篇：质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定
质粒DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定
一 目的学习质粒的酶切及电泳分析。二 原理
限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。
三 试剂与主要仪器
（一）试剂
1．EcoRⅠ酶 2．λ DNA
3．TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍 4．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油
5．溴乙啶(EB)： 10mg/ml溴乙啶 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。6．琼脂糖
（二）仪器
1．电泳仪系统2．紫外灯3．恒温水浴箱
四 操作步骤
（一）质粒DNA酶切
1．按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中，要注意管号。
管 号
质粒DNA EcoRⅠ/ μl
酶切Buffer（10×）/ μl ddH2O/ μl RNA酶
① 102 8
② 10 1 2 7
③ 10 1 2 6 1
2．加样后混匀，置于37℃水浴中，保温2小时。然后每个管中加入4 μl Loading buffer。
（二）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备称取0.4g琼脂糖加入40ml 0.5×TBE缓冲液中，加热熔解。冷却至65℃时加入2 μl EB，混匀。胶板制备将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，并在一端插好梳子。然后倒入熔好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入0.5× TBE缓冲液），拔掉梳子。注意：缓冲液要高出胶面2毫米。加样每个样品中加入1/10体积点样缓冲液，混匀后小心地加入样品槽中，要避免相互污染。1-2㎝处时，停止电泳。观察及照相将胶板拿出，用自来水小心地冲洗一下。在紫外灯下观察结果，如果有条件也可用凝胶成像系统照相。
第三篇：质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定实验报告-2015级预防医学-第2实验室
生物化学实验报告
姓 名：
学 号：
专业年级： 2015级预防
组 别： 第二实验室
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称 质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定
实验地点 指导老师
教师签名
第二实验室 实验日期 2016-12-1 合作者 评分
一、实验目的
批改日期
1.掌握PCR基因扩增的原理和操作方法 2.掌握碱裂解法提取质粒的方法
3.了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法 4.学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作
二、实验原理
1.PCR反应：加热使模板DNA在高温下90℃-95变性，双链解链；降低溶液温度使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链；溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.碱裂解法：基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异。在pH高达12.6的碱性条件下，细菌线性染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，而质粒DNA大部分氢键也断裂，当pH调至4.8的时候线状染色体DNA片段难以复性而成缠连网状结构，与变性蛋白质与细胞碎片缠绕在一起而沉淀，而质粒DNA双链又恢复原状，并溶解于液相中。
3.离心层析柱：硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋白质、多糖等物质；通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
4.紫外光吸收法：物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，而且物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。
5.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度；DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动；DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。
三、材料与方法：
材料与仪器：
PCR反应：PCR仪、加样枪、菌液（大肠杆菌DH5a菌株）、引物、2×Premix Taq、灭菌去离子水；
质粒DNA的提取与鉴定：台式离心机、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α、AXYGEN试剂盒质粒提取试剂盒、溶液 P1（S1，50mmol/L 葡萄糖、25mmol/L Tris·Cl(pH8.0)、10 mmol/L EDTA(pH8.0))、溶液 P2(S2，0.2 mol/ L NaOH、1% SDS）、溶液 P3（S3，5mol/L 乙酸钠 60ml、冰乙酸11.5ml、水28.5ml）、去蛋白液 PE（W1)、漂洗液 WB(W2）、洗脱液 EB（Eluent)；
紫外光吸收法：比色杯、紫外分光光度计；
酶切鉴定：无菌水、10×M酶切缓冲液、质粒DNA（来自质粒DNA提取步骤）、Hind III(15U/ul)、EcoR I(12U/ul)琼脂糖凝胶电泳：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000
实验方法：
煮菌，PCR（PCR程序最后设4℃保温）
↓约2小时收集PCR产物
质粒DNA提取（约1小时）
↓ 紫外检测定量
↓ 酶切步骤 ↓ 酶切约1~2小时
↓
电泳（样品：质粒DNA，PCR产物，酶切产物，Marker）
↓约30分钟 观察电泳结果、记录、拍照、保存
1.PCR反应：
菌液煮沸10min, 冷冻，室温解冻后离心取上清
↓
取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪分别加入各试剂
↓
在PCR仪中94℃预变性5分钟后开始循环（94℃30 秒，50℃30 秒，72℃↓(循环30次)72℃ 5 分钟，4 ℃ 保温
2.质粒DNA提取与定量）1min
取1.5ml培养物加入Eppendorf管中
↓
9000rpm×30 s，弃上清
↓
加入250μl 溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮
↓
加入250μl 溶液S2，颠倒6～10次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮
↓
加入400μl 溶液S3，立即温和混匀，室温放置3-5min。13000rpm离心10min，小心取上清液（700-800μl）
↓
将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液
↓
加入500μl去蛋白液(W1)，13000rpm离心1min，弃滤液
↓
向吸附柱中加入700μl 漂洗液W2，13000rpm离心1min，弃滤液
↓ 重复步骤8一次
↓
空柱13000rpm离心2min，然后室温放置3min，使残留乙醇挥发
↓
取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加60μl-100μl洗脱缓冲液(Eluent)，室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA，-20℃保存备用
酶切鉴定：
在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次加入试剂
↓
移液枪轻轻混匀,37℃水浴1.5h 琼脂糖凝胶电泳：
将PCR、酶切及提取的质粒DNA分别点样入凝胶电泳槽中
↓ 电泳 ↓ 取出观察并拍照
四、结果与讨论：
结果：在本次实验中，三种产物从左到右为酶切产物，质粒，PCR,如图1；
图1 在质粒DNA的提取中，经第一次离心过后的样品中沉淀附着于EP管壁下方；而在对提取的质粒DNA进行纯度鉴定时，可根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度（Ratio=A260/A280），Ratio= 1.8表示DNA样品较纯,符合实验要求，Ratio＞1.9表示有RNA污染，而Ratio＜1.6则表示有蛋白质或其它杂质的污染，我们所测得的A260与A280的比值分别为1.82，1.79，1.75，如图2、3、4.图2
图3
A280 0.026 0.022 0.017 0.022
图4
Ratio(A260/A280)1.82 1.79 1.75 1.79
测量次数 质粒DNA的浓度（ug/ml）A260 1 2 3平均值 119.5 100.5 73 97.67
0.048 0.040 0.029 0.039 进行琼脂糖凝胶电泳后制版上呈现颜色不同且移动路程不同的点，如图。
讨论：我们组的DNA纯度较纯，Ratio值为1.79，但未达到1.8，说明混入了蛋白质或其他杂物，有可能是在吸取上清液的时候吸入了蛋白质或者是在操作过程中操作不当，引入了污染物；也有可能是，因为前面的同学在进行紫外分光光度法测DNA的浓度及Ratio时用手多次接触比色杯的光滑面，造成了后来我们的实验数据有错误。每组质粒DNA的浓度都大于55ug/ml，说明DNA浓度较纯。
从琼脂糖凝胶电泳的实验结果来看我们组做的PCR反应及酶切鉴定都很成功，美中不足之处是质粒DNA的浓度不够，现象不是很明显，说明我们没有尽可能的吸取上清液，导致DNA含量不足。思考题：
（1）在碱裂解法提取质粒DNA时，溶液1的作用是：葡萄糖悬浮细胞，EDTA鳌合金属离子使DNase失活；溶液2的作用是：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，使核酸和蛋白质变性；溶液3的作用是在酸性条件下使质粒DNA复性，变性蛋白-SDS＋线性DNA沉淀，而Na则可中和DNA。
（2）为了提高限制性酶切的反应效率，应保证DNA的纯度，DNA样品中应不含有蛋白质、金属离子等杂质，选择合适的反应容器，并应在合适的pH、温度下进行实验及保证适当的酶浓度。＋
第四篇：质粒DNA抽提实验报告
质粒DNA抽提实验报告
一．实验目的：
1.掌握碱裂解法小量快速提取质粒DNA的方法，提取的质粒DNA可直接用于酶切，PCR扩增等。
2.学习利用水平式琼脂糖凝脉电泳初步检测DNA的纯度，构型，含量和分子量大小。
二．实验原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DN结果A的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三．实验仪器及试剂：
1.5mlEP管、高速离心机、移液枪
溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）2毫克/毫升 溶菌酶
溶液II： 200 mmol/L NaOH、1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc（pH4.8）溶液、TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.51 mmol/L EDTA 四．实验步骤:
1、取1.5ml细胞培养物于1.5mlEP管中，12000rpm/min离心1min，去上清液（重复一次）
2、加200μl溶液Ⅰ重悬浮细胞
3、加200μl溶液Ⅱ，轻轻摇匀，放置5min
4、加150μl溶液，轻轻摇匀，冰浴5min，12000rpm/min离心5min
5、取上清，加入等体积氯仿，摇匀，12000rpm/min离心10min
6、去上清，加入等体积异丙醇，室温放置5min，12000rpm/min离心10min 7、70%乙醇洗涤沉淀2次，风干
8、加20ddH2O溶解沉淀，-20℃下保存备用
五．实验结果：得到大肠杆菌质粒DNA
PCR以及电泳实验报告
一．实验原理：
PCR：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。
电泳：琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。
二．实验仪器及试剂：
EP管、离心机、PCR仪、电泳槽、电泳仪、移液枪、紫外透射检测仪等 DNA模板、与特定DNA模板结合的引物、去离子水、商业化的DNA聚合酶以及缓冲液、dNTP、DNA荧光染料溴化乙锭、琼脂糖凝胶
三．PCR反应体系（25μl）2× PCRmix 12.5μl 引物1 1μl 引物2 1μl 20ddH2O 10.5μl
四．操作步骤 1、94℃预变性5min，然后94℃，30s-64℃，45s-72℃，1min循环7次 2、94℃，30s-55℃，45s-72℃，1min循环23次 3、72℃，10s
4、电泳检测
五．实验结果分析
分离不同大小的DNA片段所用的最适凝胶浓度是不同的，数据见下表：
如右图所示：实验所用的琼脂糖凝胶浓度为1.3%，实验的DNA条带位置在500bp-750bp之间，接近500bp，证明实验是成功的
2000bp 1000bp
750bp 500bp 250bp 100bp 实验组
对照组
第五篇：dna粗提取和鉴定
dna粗提取和鉴定
实验用具
洋葱或其他植物、洗洁精、食盐、搅拌机或研钵(我们采用的是家用豆浆机)、纱布、漏斗、烧杯、玻璃棒、量筒(10mL一支)、滴管、试管(20mL两支)、天平，dna粗提取和鉴定。95%酒精、蒸馏水、0.015mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂。
实验材料的选取
凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
原理
①加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂
蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。
②加入洗涤剂和食盐的作用
洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放;食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
③研磨不充分，对实验结果产生的影响
研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
④此步骤获得的滤液中可能含有的细胞成分?
可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。
实验步骤
1.破碎细胞，获取含DNA的滤液
动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋
.葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
2.去除滤液中的杂质
方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA;方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。
注意事项
①用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质;用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
②方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开;方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。
DNA的析出与鉴定
将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA，鉴定材料《dna粗提取和鉴定》。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。
取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。
实验步骤
1.称取30克已切碎的洋葱，放入研钵中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L的氯化钠溶液，充分研磨。
洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行。上课前，教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又不能结冰;或将洋葱切成几大块，放入清水泡一会儿，让其挥发性刺激物溶于水，可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液，没必要将洋葱研成粥糊状，后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时，切忌使用搅拌器(榨汁机)。使用搅拌器虽可以提高研磨效率，但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒，无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中，许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来，DNA藏在其中，无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。
2.研磨后，用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中，得到滤液。
3.向滤液中加入95%的酒精溶液20mL，沿烧杯壁缓缓倒入，不要震动或搅拌。
此时，烧杯中的液体分为上、下两层，下层较浑浊，上层澄清，很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出，用玻璃棒可将其轻轻卷起。这就是记录生命遗传信息的重要物质——DNA。DNA析出的过程中，切忌震动和搅拌(不震动易于分层，我们就能很容易观察到上清液中的丝状物;搅拌会使非常柔软的DNA断裂成小段，不易取出)。如果用玻璃棒DNA不易卷起，可改用表面打毛的牙签，DNA提取物就缠绕在牙签上了。
4.鉴定：取两支试管，编为1、2号，各加入2mol/L的氯化钠溶液2mL，向1号试管中加入一些白色纤维状物，振荡使其溶解，然后向两支试管中各加入2mL二苯胺试剂，沸水浴加热5分钟。
注意事项
1.以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固。
2.加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
3.二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
4.DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：
当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低;当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。
5.盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。
鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。
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